文摘
白细胞介素- 6 (il - 6)是一个重要的炎症介质。il - 6的抑制剂或其信号转导受体gp130构成小说类的消炎药,这对改善提高大希望治疗痛苦的炎症性疾病,如风湿性关节炎。il - 6和gp130可能会加强疼痛不仅间接地通过他们的促炎的行动也在痛觉受器(即通过直接的行动。由痛苦的刺激,神经元激活)。我们确实发现,il - 6 / gp130中的复杂的感应热过敏在体外和在活的有机体内。这个过程是由激活PKC-δ通过Gab1/2 /π3TRPV1的K和后续监管的瞬时受体电位(TRP)离子通道的家庭。这种直接的相关性疼痛评估促进il - 6的影响,我们生成的条件胜过老鼠,它所缺乏的gp130特别是在痛觉受器,在炎症和肿瘤导致疼痛模型进行了测试。这些老鼠表现出显著降低水平的炎症和肿瘤导致的疼痛,但没有免疫反应变化或肿瘤的生长。我们的研究结果揭示的意义gp130外围疼痛感觉神经元表达主要临床疼痛障碍的病理生理学和建议他们用小说在炎症和肿瘤疼痛疼痛缓解代理。
介绍
慢性炎症的疼痛管理条件,如类风湿性关节炎(RA),仍然是一个主要的临床挑战。大量的临床前研究一直专注于解密事件的病理生理后遗症发生在免疫细胞在慢性炎症。然而,从理解的角度引起的慢性疼痛在这些州,同样重要的是去理解和解决两国之间的相互作用的免疫细胞和感觉神经。局部释放细胞因子是一个关键类分子尤其相关的上下文。了多方面的证据表明,细胞因子发挥关键作用的病理生理学炎症。各种各样的关键细胞因子,如白细胞介素- 6 (il - 6)、IL-11,白血病抑制因子(生活),制瘤素M (OSM),睫状神经营养因子(据),和cardiotropin-1 (CT-1),使用信号传感器糖蛋白130 (gp130)信号到肥大细胞,巨噬细胞和其他免疫细胞(吉田et al ., 1996;贝茨et al ., 1998)。
其中,多效细胞因子il - 6在健康个体尤其值得注意,因为它的水平非常低,但在痛苦的炎症条件下显著升高(基弗et al ., 2001;史密斯et al ., 2001)。在老鼠、il - 6的直接注入导致过敏症热力和机械刺激(普尔et al ., 1995;奥卡河et al ., 1995;DeLeo et al ., 1996;Brenn et al ., 2007)。il - 6与膜结合或可溶性白介素受体复合物,IL-6R,激活细胞表达信号的换能器糖蛋白gp130 (Taga et al ., 1989;Rose-John海因里希,1994)。有趣的是,大多数细胞缺乏膜结合IL-6R,从而对细胞因子il - 6。这些细胞,然而,仍然可以对il - 6与可溶性形式的混合IL-6R (sIL-6R)激活gp130途径称为“反式-信号”(Rose-John海因里希,1994)。有趣的是,sIL-6R生成期间,凋亡中性粒细胞炎症状态(Chalaris et al ., 2007)。除了免疫和骨髓细胞,gp130也表达了在大鼠感觉神经元(Opree和克雷斯,2000;嘉丁纳et al ., 2002;Obreja et al ., 2002 a,2005年)。然而,gp130表示对感觉神经的功能作用还不是很清楚。此外,gp130下游信号事件的感觉神经还没有被开发,也不知道这些可能影响关键疼痛的分子,如离子通道参与疼痛传导。
我们假设gp130感觉神经上的表达可能功能与病理性疼痛。专门描绘的功能作用细胞因子信号通过gp130在感觉神经元,我们使用一个条件基因打靶小鼠的方法基于选择性删除gp130从外围感觉神经元,保留其在其他细胞表达。我们的研究结果表明,gp130不仅表现在感觉神经介导慢性炎性疼痛,但也大大有助于复杂的免疫细胞之间的相互作用,肿瘤细胞和神经的上下文中cancer-evoked疼痛。此外,我们发现il - 6激活gp130 Gab1 / Gab2,π3K, PKC-δ和调节TRPV1作为一个关键机制与细胞因子释放的痛觉敏感的神经。
材料和方法
转基因小鼠。
老鼠液氧等位基因的纯合子的鼠标Il6st基因(gp130fl / fl)、白细胞介素- 6的编码信号传感器(Il6st,从今以后gp130)前面描述的(贝茨et al ., 1998)。gp130fl / fl老鼠杂交,SNS-Cre老鼠(阿加瓦尔et al ., 2004)获得纯合SNS-Cre gp130fl / fl(SNS-gp130−−/),gp130fl / fl老鼠(控制同窝出生的;重组酶homo -或杂合的)。所有老鼠基因分型用老鼠基因组DNA尾感觉引物5′-TGGCTTGAGCCTCAGCTTGGCTAG-3′和反义引物5′-TGAACAGTCACCATGTACATCTGTACGC-3检测液氧gp130等位基因,和引物5′-GAAAGCAGCCATGTCCAATTTACTGACCGTAC-3′和反义引物5′-GCGCGCCTGAAGATATAGAAGA-3′检测SNS-Cre转基因表达。SNS-Cre老鼠,SNS-gp130−−/老鼠和它们相应的同胞(野生型(wt)和gp130fl / fl小鼠,分别有遗传背景C57BL / 6 j。所有的老鼠防晒系数条件下进行维护。同窝出生被用于所有实验控制背景影响,和所有动物使用程序都按照道德准则和动物福利标准根据奥地利法律。行为的测量都是在醒着,无拘无束,与老鼠> 8周大的人被蒙蔽到老鼠的基因型分析。
南方的污点。
基因组DNA从野生型,gp130fl / fl和SNS-gp130−−/大鼠背根神经节(drg)裂解一夜之间在37°C使用生态RI(罗氏)10×生态国际扶轮缓冲区(罗氏)。DNA含有溴化乙锭0.7%琼脂糖凝胶上分离,然后涂抹到尼龙膜(GeneScreen + PerkinElmer生命科学)和放置在一个紫外线透照器(2400年UV-Stratalinker Stratagene)。的gp130基因组DNA探针与α-标记32P-dCTP (10.0 mCi / ml, PerkinElmer生命科学)使用Megaprime DNA标记系统(通用电气医疗集团)。膜prehybridized 3 h在50°C杂交缓冲区包含5×Denhardt的解决方案(牛血清白蛋白(σ),聚乙烯吡咯烷酮(σ),聚蔗糖400(σ),5×SSC, 1% (w / v) SDS(σ),和100年μg /毫升退化鲑鱼精子DNA) (Sambrook和罗素,2001)。探测器是变性,添加到杂交缓冲,一夜之间杂化50°C。膜被短暂洗2×SSC / 0.1% SDS在50°C其次是2×SSC / 0.1% SDS 2×30分钟在0.1×50°C,然后SSC / 0.1% SDS 10分钟50°C。结果检查后暴露在x射线胶片(通用电气医疗集团)。
定性和定量PCR。
分别定性PCR进行RNA, cDNA、隔绝鼠背根神经节(DRG)神经元,对待三试剂(σ),限制DNase我(Fermentas)和反向转录与亲逆转录酶(应用生物系统公司)。特定PCR引物是根据NCBI引用的序列。底漆表达软件,版本3.0(应用生物系统公司)是用于定义底漆基地宪法,长度和熔化温度。寡核苷酸在MWG购买(欧陆坊MWG操纵子)。以下套引物被使用:1,感觉引物5′-GATAACCTGCTCTGGGTGGA-3′,反义引物5′-TGGAGTTAAAATTGTG CCTTGG-3′;组2,感觉引物5′-ACCAGATTCCTGTGGACGAC-3′,反义引物5′-TGACCACTGGGCAATATGAC-3′。所需的突变的存在产生的400个基点的碎片(野生型,gp130fl / fl)、300个基点(SNS-gp130−−/)证实了测序(Microsynth AG)。周期协议的第一个PCR由1分钟在94°C, 20三步循环30年代在94°C, 60年代每个在57°C,和120年代每个在72°C,和最后一个扩展在72°C的10分钟。嵌套PCR是提到的;只有周期的数量被调整到30。分别用于分析基因表达水平的mRNA水平,总RNA分离小鼠治疗和治疗动物的DRG神经元后立即准备用三试剂(σ)根据制造商的指示。RNA是DNase对待我(Fermentas)。执行反向转录cDNA使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(应用生物系统公司)。每个cDNA gp130的样本分析表达式定量实时PCR使用TaqMan 5′核酸酶化验Mm01297292_m1 (gp130,外显子边界16 - 17),Mm0129298_m1 (gp130外显子边界8 - 9)和Mm01352363_m1(琥珀酸脱氢酶亚基,SDHA)。的外显子15(跨膜区域)MGB探针(5′-TGTGCTTAGCCTTCC-3′)和引物5′-GAAATAGAAGCC-3′, 5′-CCTGACAACCCTGCTGGGCGT-3′,(所有应用生物系统公司),分别。反应进行的微安快速光学反应96孔板(应用生物系统公司)使用7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)热循环和实时荧光测量。PCR循环协议由10分钟在95°C,和40两步15秒每个周期在95°C和1分钟60°。积极的和消极的控制被包含在所有的实验,每个样本运行每个PCR一式三份。阈值周期(CT)的测量值记录初始模板浓度。相对褶皱的变化由ΔΔC RNA水平计算T方法使用SDHA作为参考标准。范围为目标,相对于校准器样本计算2−ΔΔCT。
初级感觉神经元的文化。
腰椎drg细胞的初级传入纤维项目进入hindpaw从成年老鼠收获以前公布的(Obreja et al ., 2002 b;阿加瓦尔et al ., 2007)。切除后结缔组织,神经中枢被孵化Liberase Blendzyme 1(9毫克/ 100毫升DMEM,罗氏)60分钟。与PBS (PAA)清洗后,1×Trypsin-EDTA(表达载体)增加了30分钟,和drg洗TNB介质(Biochrom)包含l-glutamin(表达载体),青霉素G钠、硫酸链霉素(表达载体),和一个Protein-Lipid-Komplex (Biochrom)。drg被磨碎fire-polished巴斯德吸管和离心机通过3.5% BSA梯度(σ)。镀resuspended感觉神经元,在盖玻片上涂以赖氨酸/层粘连蛋白(σ),在补充和培育TNB包含mNGF (Alomone实验室,10μg / 100毫升TNB-medium)有限公司37°C的5%224-36 h。
肿瘤细胞的文化。
1642年肺癌细胞(ETCC克隆,欧洲类型细胞培养组)在DMEM培养l谷氨酰胺和10%胎牛血清的边后卫。细胞计数,注入之前,洗两次,然后在PBS resuspended(25μl)。小鼠麻醉与isofluorane(百特)和7×105肺癌细胞在足底皮下注射和鼠标hindpaw背的一面。
免疫细胞化学和活细胞标记。
根据协议和DRG神经元的镀在盖玻片。在文化24 h后,神经元是固定的4% PFA 20分钟,permeabilized tx - 100为0.01%(σ)2分钟和阻塞阻止缓冲区(BB, 10%山羊血清在PBS) 30分钟,细胞被孵化主要抗体稀释BB(1:200)在室温下1 h (RT),用PBS,孵化和二次抗体(1:1000)30分钟在RT,核染色和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:10,000 PBS)和细胞嵌入Mowiol (Calbiochem)。细胞计数进行至少一式三份的实验。活细胞标记DRG神经元孵化在冰中的主要抗体稀释TNB介质(1:50)30分钟,用TNB中10分钟在冰上和孵化二级抗体稀释TNB介质(1:1000)。随后细胞被固定为4% PFA和免疫组织化学。
冰冻切片免疫组织化学。
drg洗与PBS和固定4% PFA 20分钟。3×10分钟后洗PBS,神经节methylbutan冻结。部分(12μm)与徕卡1850厘米Cryomicrotome被削减,permeabilized tx - 100为0.1%,并与阻断缓冲区阻塞。一夜之间,部分被孵化与初级抗体在湿室+ 4°C。在PBS洗涤后,部分二次抗体孵育,嵌入Mowiol (Calbiochem)。间接免疫荧光检测用蔡司Axiovert 200显微镜与MetaMorph成像和分析软件系列7.1(分子器件、Visitron系统)。以下使用抗体:anti-gp130(1:50,细胞外的抗原决定基Neuromics);anti-Nav1.8 (1∶h . g .呈递博士教授是一个慷慨的礼物,因斯布鲁克,奥地利)(参见补充图。2,可用www.jneurosci.org作为补充材料)(刘et al ., 2006);anti-CGRP(施用ImmunoStar), anti-Isolectin IB4(1:1000表达载体);Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(1:1000,H + L), Alexa萤石594,驴抗体免疫球蛋白(1:1000,所有表达载体)。
西方墨点法。
感觉神经元在保利-镀l赖氨酸/ laminin-coated盘子,保存在文化24 h,刺激与5 ng / ml HIL-6 10分钟在细胞外的解决方案(ECS)和收获刚做好的冰冷的裂解RIPA-buffer(50米米Tris-HCl, 150米氯化钠,50米米氟化钠,5米米EDTA, 0.5%去氧胆酸,0.1% SDS, 1%诺乃清洁剂p 40,σ)。磷酸酶抑制剂sodium-orthovanadate(200μ米)和β-glycerophosphate(40米米,两个σ)添加到保持蛋白质的磷酸化状态。蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(σ)被用来保护蛋白质免受蛋白水解作用。sds - page标准变性条件下进行使用8.3×7.3厘米handcast凝胶(Mini-PROTEAN Bio-Rad实验室)。等量的蛋白质被加载每个车道10%聚丙烯酰胺凝胶。光谱多色广泛蛋白质梯(Fermentas)作为分子量标准。凝胶电泳后立即被涂抹上聚偏二氟乙烯膜(Hybond-P,通用电气医疗集团)。immunodetection,膜被封锁1.5 h和5% (w / v)脱脂奶粉或5% (w / v) BSA和0.1% (v / v)渐变20 Tris-buffered盐水,pH值7.6,在室温下,根据制造商的指示和加工的抗体。以下使用抗体:anti-tubulin(σ),anti-phospho-Gab1 (Tyr307) anti-phospho-Gab2 (Tyr502) anti-phospho-PI3K p85 (Tyr458) /过去(Tyr199)(所有细胞信号技术),anti-Gab1 (h - 198),和anti-Gab2(我18)(圣克鲁斯生物技术)。可视化增强化学发光的墨迹了通过使用ECLPlus免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团)。
PKC-δ易位。
培养神经元刺激与5 ng / ml HIL-6 ECS 10分钟,固定在4% PFA 20分钟,permeabilized 0.2% tx - 100为5分钟,堵塞10%门店,和沾anti-PKCδ(BD转导实验室)。图像是由蔡司获得Axiovert模块510 200激光共焦显微镜。量化的再分配PKC-δ刺激后,行扫描的荧光强度与MetaMorph记录成像系列7.1软件(Visitron系统)。这个概要文件的总长度以及细胞的直径设置为100%,和概要文件的荧光强度介于0和10%和100%和90确定(外围)45之间的结合强度和55%的概要文件(中心的细胞)。易位系数(K)计算值之比确定的平均外围除以细胞内的中心价值以前公布的(Rathee et al ., 2002)。K= 1,如果是均匀分布在整个细胞的酶,K> 1是指主要定位接近等离子体膜,和K< 1代表一个主要细胞质本地化。
膜片箝记录。
DRG神经元在文化被用于电生理学后24 h。全细胞离子电流记录从孤立的神经元的全细胞膜片箝技术如前所公布的配置(Obreja et al ., 2002 b,2005年)。ECS包含(m米):150氯化钠,氯化钾,0.1 CaCl21 MgCl210(σ),葡萄糖,和10个玫瑰(默克公司),在pH值7.3调整与氢氧化钠(默克公司)。钙是减少到0.1米为了避免脱敏capsaicin-induced电流。硼硅玻璃吸量管与水平拉杆(科学产品)拉(萨特仪器公司)充满了内部解决方案(ICS) (m米):148氯化钾2 MgCl22 Na-ATP 0.1 CaCl21 EGTA(σ)和10个玫瑰(默克公司),在pH值7.3调整KOH(默克公司)。4 - 5 MΩ灌装后,电极电阻。神经元被夹在−80 mV的潜力。电流在2.9 kHz,过滤在3千赫采样,记录一个EPC 9 (HEKA)和脉冲v8.74软件(HEKA)。实验在室温下进行,每个培养皿中只有一个神经元进行了测试。7桶系统常见的出口是用于快速药物管理局和热刺激单神经元(Dittert et al ., 1998)。Capsaicin-activated内向电流(我帽通过应用0.3μ)引起米辣椒素(σ)10 s后2分钟冲刷与控制解决方案。这个协议之前重复了3次HIL-6 (1 ng / ml)申请1分钟立即在辣椒素调节刺激。从鼠标重组白细胞介素- 6 (il - 6σ)解决了包含10% BSA在PBS。il - 6 (5 ng / ml)和BSA(车辆;0.1毫克/毫升),分别在细胞外的解决方案。
皮肤神经准备和单纤维录音。
一个在体外皮肤神经准备用于调查的性质传入神经纤维支配的皮肤鼠标背hindpaw以前公布的(克雷斯et al ., 1992;Koltzenburg et al ., 1997)。短暂,准备过冷(15毫升/分钟)与一个oxygen-saturated改性合成组织液的解决方案包含(m米3.48)108氯化钠,氯化钾,3.5 MgSO426 NaHCO31.7不2阿宝42.0 CaCl27.6 5.5,9.6葡萄糖酸钠,葡萄糖,蔗糖在31±1°C,温度和pH值7.4±0.05。单一的感觉神经元的动作电位记录extracellulary从细纤维从坐骨神经解剖,放大(5000倍),过滤(低通1 KHz,高通100 Hz),在示波器可视化,存储在一个单机计算机与峰值/ Spidi软件包(福斯特和汉沃克1990)。被认为是无髓鞘的纤维(C)根据看过他们的传导速度(的简历了。< 1.4 m / s)。接受域被机械探测皮肤用玻璃棒;标准线性上升的热刺激皮内的温度从31±1°C到47°C的应用。纤维被认为是热敏感期间如果3个或更多的动作电位诱发刺激。热阈值被定义为温度引起的第三高峰的反应。tumor-injected小鼠电生理记录进行7 - 10 d后接种时肿瘤注射部位形成的质量。
电子显微镜。
SNS-gp130−−/和相应的gp130fl / fl灌注控制老鼠transcardially刚解聚甲次砷酸盐缓冲含有2%多聚甲醛和glutardialdehyde 2%,其次是股神经解剖、osmification,嵌入在Spurr′年代介质如前所述(Carenini et al ., 2001)。超薄部分(80海里)与柠檬酸铅和分析使用ProScan慢扫描CCD相机(ProScan)安装到狮子座906 E电子显微镜(蔡司)和相应的软件项目(奥林巴斯)。
片记录。
脊髓片14 - 20-d-old老鼠通过一个标准的过程。简而言之,老鼠和异氟烷麻醉斩首,脊髓在冰冷的microdissected ACSF(包含125米米氯化钠,26米米NaHCO31.25米,米不2阿宝42.5米,米氯化钾、2米米CaCl2,1米米MgCl2,10米米葡萄糖),粘在一块凝胶和vibroslicer额片了。腰椎片和完整背延伸与铂网格固定在记录室和一个双极刺激电极(250μm极距离)被两边的细根。背角神经元的突触电流(层2/3)为了应对刺激的初级传入纤维与短脉冲(0.2毫秒时间、脉冲距离12 s)记录EPC10和补丁大师软件(HEKA)使用补丁吸量管充满K-gluconate-based内部解决方案(Cl−逆转潜在−90 mV)。刺激阈值被确认为最低电压强度响应概率> 50%。
行为测试。
标准测试程序被用来量化疼痛,如行为的迹象。测试区域是足底的hindpaw接种肿瘤细胞所处的位置。热敏感度评估使用哈格里夫斯测试(哈格里夫斯et al ., 1988)。爪子撤军延迟响应越来越热刺激(尤格Basile)自动测量之前和之后的细胞因子注入或肿瘤细胞注射时间点数据的表示。coinjecting il - 6与sIL-6R一起,而是设计师肽hyper-IL-6 (HIL-6)被用来模拟的影响il - 6 / sIL-6R复杂(费舍尔et al ., 1997)。完全弗氏佐剂(CFA, 20μl,σ)注入到足底hindpaw的网站gp130fl / fl和SNS-gp130−−/老鼠,机械和热灵敏度的变化测量6,24和48 h后接种。在观察期结束后,肿瘤被切除在托托从结缔组织,清洁,立即重。CCI的坐骨神经,老鼠被腹腔注射苯巴比妥麻醉,和三个绷带(7 - 0缝线)与1毫米的距离每一个松散的系在了神经近端直到三根分叉部短电影hindpaw被观察到。
统计分析。
详细统计分析SigmaStat 3项目使用。提出了数据分析了均值±SEM和使用魏克森讯号等级测试,配对t测试或单向重复测量方差分析比较组和测试天,紧随其后的是一个学生t测试如果不是另有说明。被认为具有统计显著性差异p< 0.05。
结果
动物缺乏广泛表达信号的换能器白介素受体β亚基gp130死后12.5 d postconception或产后,根据遗传背景(吉田et al ., 1996;川崎et al ., 1997)。因此,有条件的淘汰赛老鼠缺乏gp130诊断相关疼痛的神经元的选择性生成使用Cre重组酶loxP策略和条件的跨膜外显子15(指从今以后SNS-gp130−−/老鼠)。这是通过交配纯合子小鼠携带loxP在(液氧)gp130等位基因(130年fl / fl)(贝茨et al ., 1998)用鼠标线表达Cre重组酶的转录控制下nociceptor-specific Nav1.8基因(SNS-Cre)。在SNS-Cre小鼠,基因重组发生选择性> 90%的体积小(≤28μm)疼痛的感觉神经元,出生时开始,不影响基因表达在其它地区(阿加瓦尔et al ., 2004)。删除gp130在DRG神经元被印迹分析基因组DNA的鼠标按使用gp130特殊探头,通过定量PCR分析(补充图1,可以在www.jneurosci.org作为补充材料)。确认gp130从细胞膜蛋白质会缺席,生活与抗体针对免疫染色进行细胞外gp130域和Nav1.8离子通道在神经元文化中获得gp130fl / fl和SNS-gp130−−/老鼠,这表明> 90%的Nav1.8阳性的神经元SNS-gp130−−/老鼠没有显示anti-gp130免疫反应性细胞表面(图1一个,B)。因此这三个独立的方法提出一种有效的重组和删除功能gp130疼痛的神经元。相比之下,表达gp130完好无损在其他组织,包括免疫细胞,在SNS-gp130−−/老鼠(数据未显示)。
小型神经元SNS-gp130−−/缺乏gp130免疫反应性,但否则正常。一个、双标记的SNS-gp130−−/和gp130fl / flDRG神经元anti-gp130和anti-Nav1.8。规模的酒吧,15μm。B背根神经节神经元的组织,实时成像显示colabeling gp130免疫反应性和Nav1.8免疫反应性在90%的神经元gp130fl / fl老鼠,但是缺乏gp130膜免疫反应性在90%的Nav1.8免疫反应性的神经元SNS-gp130−−/老鼠。
没有明显的发育异常发生在gp130从感觉神经元的损失。因为细胞因子il - 6等信号通过gp130或生活是重要的生存因素和调节神经元兴奋性(Marz et al ., 1999;谢弗et al ., 1999;Brenn et al ., 2007;川崎et al ., 2008),我们评估的两个主要的类是否疼痛的DRG神经元,即肽能的、CGRP-expressing (CGRP怎样+)和nonpeptidergic Isolectin B4绑定(IB4 +)痛觉受器(Caterina和朱利叶斯,1999年从野生型的同胞)是不同的。的形态和整体频率IB4和CGRP怎样+神经元数量与野生型相似SNS-gp130−−/按(图2一个,B),这表明缺乏gp130信号传感器并不影响感觉神经元的形态或一般的结构属性。电子显微镜显示没有nonmyelinated神经纤维的病理改变SNS-gp130−−/老鼠(图2C,D)。脊髓背角的一般形态和电生理参数的突触脊髓胶状质的传播类似于鼠标菌株(补充图3一个,B,可以在www.jneurosci.org作为补充材料)。公开的电动机或其他行为赤字并没有观察到SNS-gp130−−/相比同窝出生的老鼠。
感觉神经中枢和周围神经的正常形态SNS-gp130−−/。一个,BIB4分布、CGRP怎样在DRG部分获得免疫反应性是相似的gp130fl / fl和SNS-gp130−−/老鼠。IB4——或者CGRP-immunoreactive神经元的百分比在诊断相关的部分也比较两个鼠标菌株。这表明肽能的和nonpeptidergic小型神经元数量是正常的SNS-gp130−−/老鼠。所有的实验都重复在至少3动物。C,D电子显微镜在nonmyelinated隐神经的神经纤维gp130fl / fl控制和SNS-gp130−−/老鼠在4 - 6个月的年龄。星号划分nonmyelinated轴突;箭头指向nonmyelinating雪旺细胞的胞质过程。黑暗的结构周围的大口径轴突髓鞘。请注意,没有突变的神经病理改变。
从感觉神经元功能gp130损失的后果
没有观察到明显的区别对于基底热老鼠缺乏神经gp130疼痛敏感性。自从发现il - 6在炎症组织的高水平,我们调查SNS-gp130−−/小鼠模型的inflammation-induced痛觉过敏。皮下接种20μl CFA(1毫克/毫升)的足底网站hindpaw导致炎症和过敏性有毒热刺激的发展,都在gp130fl / fl和SNS-gp130−−/小鼠注射后6小时内(图3一个)。然而,尽管肿胀的程度,这是炎症的迹象,在鼠标菌株(非常相似图3B)、热痛觉过敏明显减弱SNS-gp130−−/相比之下,gp130fl / fl老鼠(p< 0.001,方差分析)。在gp130fl / fl老鼠,炎症痛觉过敏在6 h和充分发展保持在恒定水平48 h。相比之下,一个初始峰值后6 h,SNS-gp130−−/显示明显的复苏从痛觉过敏的状态,虽然炎症持续(图3一个)。
热痛觉过敏在疼痛模型所需的神经元gp130。一个后,热量的变化敏感性单边hindpaw注入CFA的gp130fl / fl和SNS-gp130−−/老鼠。爪子撤军延迟响应坡道热刺激应用于炎症面积在所有时间点明显减弱SNS-gp130−−/老鼠(n= 18)相比gp130fl / fl(n= 17)。星号表示显著差异(p< 0.001,两组之间的方差分析)。B相比之下,没有区别的爪子直径菌株之间的观察,表明同等程度的CFA炎症发生尽管神经元gp130删除。C,D,PWL ramp-shaped热刺激应用于足底的同侧(□)和对侧的hindpaw(■)肿瘤gp130fl / fl(C,n= 23)和SNS-gp130−−/(D,n= 17)老鼠。肿瘤诱导后gp130fl / fl老鼠,爪子撤军延迟明显减少(p< 0.05,方差分析),从第一天开始注射和持续10 d后的调查。小鼠与感官的特异性神经元缺失gp130开发重要的热敏感肿瘤诱导后只有8天。星号表示显著差异(p同侧和对侧的< 0.001)之间的爪子。E,F,放电的热敏性c fibers支配背站点hindpaw记录的在体外皮肤神经准备从gp130fl / fl(E),SNS-gp130−−/(F老鼠)。热敏c fibers平均放电率gp130fl / fl肿瘤小鼠(n= 8)相比显著高于与控制(天真)小鼠(E,n= 12,p< 0.05,方差分析)。肿瘤诱导的SNS-gp130−−/老鼠并不影响放电率的热敏性纤维(F,p> 0.05,方差分析)。G,足底和背肿瘤的权重是相同的突变和液氧老鼠(n。不显著)。
癌症疼痛的神经gp130意义
小说癌症疼痛模型小鼠,我们最近发现的皮下注射LL2 hindpaw细胞癌,肿瘤间质炎症反应的迹象,被巨噬细胞密集入侵,众所周知,产生大量的细胞因子激活(江诗丹顿et al ., 2008)。在这个模型中,肿瘤的生长伴随着发芽的肽能的神经纤维进入肿瘤质量,进步的机械和热痛觉过敏和痛觉受器的一个重要敏感wt C57BL6J老鼠(江诗丹顿et al ., 2008)。随着肿瘤的发展,进步观察热痛觉过敏gp130fl / fl老鼠(p< 0.001,方差分析,n= 23)(图3C)。在SNS-gp130−−/老鼠、热痛觉过敏明显减弱,温和的热痛觉过敏的迹象发达后仅在晚期肿瘤诱导(图3D)。这有益的影响不是由于减少肿瘤生长或炎症,因为肿瘤生长和爪肿胀是相似的gp130fl / fl和SNS-gp130−−/老鼠(图3G)。
神经元肿瘤相关所需gp130伤害感受器敏感
在wt C57BL6J小鼠肿瘤导致痛觉过敏伴随着敏感的热敏性疼痛的纤维支配的皮肤肿瘤区域。因此,我们推测,激活神经元gp130可能伤害感受器敏化过程和执行单一纤维的关键录音从无髓鞘的疼痛的皮肤神经初级传入纤维在体外准备(Reeh 1986;Koltzenburg et al ., 1997)。在体外、热敏无髓鞘的纤维gp130fl / fl在热刺激肿瘤的小鼠表现出更高的平均放电率与纤维相比,从控制没有肿瘤的小鼠(4.53±1.00冲动(imp) / s和2.27±0.53 imp / s;p< 0.05;方差分析(图3E)。在SNS-gp130−−/小鼠肿瘤,意味着热响应大小类似于从天真的健康小鼠痛觉受器记录(p> 0.05;方差分析(图3F)。这表明gp130表达疼痛的初级传入纤维扮演重要的角色在肿瘤导致的生成热痛觉过敏和痛觉神经元的直接调节灵敏度。没有gp130的重大贡献是神经性疼痛的观察模型,热痛觉过敏的发展被推迟,但并不阻止。这可能是由于缺乏一个主要炎症组件在这个模型(补充图。4,可用www.jneurosci.org作为补充材料)。
相关性的il - 6与肿瘤有关的疼痛和伤害感受器敏感
上述分析表明,gp130表示在感觉神经引起的病理生理过程中起着直接作用在感觉神经细胞因子。深入研究分子事件功能链接细胞因子诱导的gp130痛觉超敏反应,我们求助于il - 6,一个关键的细胞因子参与病理炎症性疾病和痛苦。在肿瘤材料我们还发现il - 6 mRNA的表达,并没有发现在LL2细胞培养注入爪子(图4一个),建议一个upregulation il - 6表达的肿瘤细胞或免疫细胞有关在活的有机体内。相应地,我们发现重大upregulation肿瘤组织中il - 6蛋白含量与健康控制组织(例如,骨骼肌)(图4B)。
IL6-induced热痛觉过敏和神经元gp130的重要性。一个,il - 6 mRNA表达在肿瘤的老鼠紧张但没有LL2细胞培养;和B,il - 6水平(pg细胞因子/毫克蛋白)都明显高于肿瘤匀浆(足底和背)与控制组织(肌肉和脊髓)分离出11个老鼠。C,D,Intraplantar注入HIL-6(1 10μlμg)gp130fl / fl(n= 8)和SNS-gp130−−/老鼠(n= 10)诱发一滴PWL热刺激的反应。星号表示的数据点的显著差异(p< 0.001,方差分析)之间的同侧(□)和侧(■)边观察。PWL下降值明显降低gp130fl / fl(n= 8)相比SNS-gp130−−/老鼠(p< 0.01,方差分析,n= 10)。E,F。放电的热敏性HIL-6前后c fibers (1 ng / ml)应用程序中接受字段在体外皮肤神经准备从gp130fl / fl(E),SNS-gp130−−/(F老鼠)。HIL-6申请5分钟诱导显著增加热C-nociceptors的平均放电率gp130fl / fl(E,p< 0.01,配对t测试中,n= 7)。热敏c fibersSNS-gp130−−/老鼠不受HIL-6刺激(F,p> 0.05,Wilcoxon等级测试,n= 7)。G,H,我热显著促进HIL-6后(H),峰值电流振幅的增加伴随着转变激活阈值温度(G)。
在大多数组织中,il - 6需要一个配体结合可溶性受体亚基(sIL-6R),该复合物与膜结合gp130信令单元。Chalaris等人最近的一项研究表明,中性粒细胞,通常先于传入的巨噬细胞,在炎症状态(sIL-6R的主要来源Chalaris et al ., 2007)。这表明,il - 6和sIL-6R都存在于肿瘤组织。设计师融合肽、HIL-6可以绑定并激活gp130和模仿il - 6 / sIL-6R效应在许多组织(费舍尔et al ., 1997)。我们使用HIL-6作为一种工具来调查是否激活gp130影响疼痛小鼠的行为。注入HIL-6(1 10μlμg) gp130 hindpaw的脚垫fl / fl老鼠爪子急剧下降导致延迟撤军(PWLs)热刺激从8.89±0.43之前4.20±0.43年代接种后30分钟(p< 0.001;方差分析)。PWL恢复到注射前值24 h内(图4C)。相比之下,gp130fl / fl同窝出生的,爪子HIL-6-induced下降延迟撤军nociceptor-specific明显减弱SNS-gp130−−/老鼠(图4D),这表明HIL-6-induced热痛觉过敏的主要部分需要gp130表达膜的伤害感受器终端或轴突。发现只有一小部分的敏感神经gp130的独立,和可能导致继发性炎症介质的释放与其他gp130-expressing细胞类型,例如,通过gp130-independent受体的细胞因子信号,如制瘤素M受体(OSM-R)和interleukin-27受体WSX-1 (Scheller et al ., 2005)。基于观察到变化的大小在上面的实验中,我们建议,il - 6在这方面是最重要的细胞因子之一。与上面一致,疼痛敏感性报道在小鼠缺乏白细胞介素6减毒或中和后在野生型小鼠内源性il - 6 (费雷拉et al ., 1993;徐et al ., 1997;墨菲et al ., 1999)。此外,我们观察到其他细胞因子gp130活化剂,如白血病抑制因子(生活),既不诱导热过敏在活的有机体内和敏化疼痛的神经元在体外(补充图。5、可用www.jneurosci.org作为补充材料)。
进一步的证据在表型观察il - 6的关键作用SNS-gp130−−/老鼠被发现在以下实验。皮肤神经的制备、应用HIL-6 (1 ng / ml)的接受域无髓鞘的热敏性纤维诱导反应的一个重要增加一个标准ramp-shaped热刺激的热敏c fibers 64% (7/11)gp130fl / fl老鼠(图4E;平均流量2.01±0.42 imp vs 4.17±0.72前/ s imp HIL-6后/ s;p< 0.01;配对t测试)。这个敏感发生后5分钟内HIL-6应用程序,并伴随着重大转变的激活阈值较低的温度(38.0±1.8°C之前和34.3±0.9°C HIL-6后5分钟;p< 0.05配对t测试)。相比之下,没有纤维记录SNS-gp130−−/老鼠对HIL-6强热响应(图4F;n= 7;n。Wilcoxon等级测试)。在一起,数据显示,gp130需要痛觉受器il - 6表达诱导热过敏在活的有机体内和热痛觉受器的敏感在体外。
最后,我们执行培养神经元电生理研究野生型drg隔绝,直接表明HIL-6 capsaicin-sensitive神经元对热刺激处于敏感状态。特别是,我们发现了一个显著增加heat-activated内向电流与HIL-6条件刺激后的孤立的背根神经节神经元(小直径图4G,H),它是伴随着一个转变的激活阈值较低的温度。
IL-6-induced感觉神经元的信号
然后我们试图澄清的主要信号组件gp130引人注目的功能角色我们观察到的疼痛调制。辣椒素和热敏感离子通道TRPV1, TRP成员(瞬时受体电位)离子通道家族作为分子传感器在疼痛的神经终端(Caterina et al ., 1997;斯科特和朱克,1998年;朱利叶斯Basbaum, 2001;小须鲸和做饭,2002;Montell 2005),有足够的证据表明,TRPV1监管,炎症介质为热痛觉过敏的产生是至关重要的(戴维斯et al ., 2000;壮族et al ., 2001)。我们假设TRPV1可能受gp130信号。激活TRPV1不仅通过热刺激而且辣椒素,辣椒的辛辣成分,在小型神经元,HIL-6诱导capsaicin-activated离子电流的快速瞬态增强作用(我帽)从1.04±0.34之前nA nA HIL-6后(1.82±0.07图5一个;补充图。6,可用www.jneurosci.org作为补充材料)。一个类似的增加我帽调节刺激gp130后也获得了吗fl / fl神经元与重组il - 6 (图5B),这表明il - 6绑定受体α亚基也表示在疼痛的细胞膜。这与il - 6的敏化效果的老鼠需要可溶性白介素受体(Obreja et al ., 2005)。最少、il - 6的调节效果完全废除在神经元缺乏gp130蛋白质SNS-gp130−−/老鼠(图5B)。使用capsaicin-induced兴奋性内向电流读出,我们解决底层信号通路和Gab1 / Gab2提出了一个角色,π3K和PKC-δ(海因里希et al ., 2003)。我们用phosphospecific抗体进行免疫印迹实验,显示适配器蛋白质Gab1 Gab2 (Nishida et al ., 1999),和π3K在DRG神经元与HIL-6刺激后磷酸化(图5C)。在渥曼青霉素(1μ米),一个π3K抑制剂,HIL-6不再诱导的敏化作用我帽(图5D)表明π3K参与gp130下游信号级联的疼痛的神经元。众所周知,蛋白激酶C (PKC)可以招募π3K SK-N-BE细胞激活(巴解组织et al ., 2004)和易位的PKC从胞质膜相关位置内PKC激活的细胞是一个敏感的指标。背根神经节感觉神经元在大鼠,PKC-δ和PKC-ε显然是转移到膜表面与治疗的PKC活性phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) (凯撒和麦克诺顿,1996)。PKC-δ以来与π3K激活,我们调查是否这个同种型接触HIL-6后转移。在未经处理的神经元gp130fl / fl和SNS-gp130−−/老鼠,PKC-δ是分布在细胞质均匀。刺激PKC-δHIL-6激活引起的,可见细胞膜与细胞溶质再分配。相比之下,没有观察到PKC-δ迁移在突变小鼠的感觉神经元(图5E,F)。符合的易位PKC-δ,非选择性PKC抑制剂BIM-1(数据未显示)和PKC-δ抑制剂Rottlerin (Gschwendt et al ., 1994)显著减少或废除了HIL-6-induced便利化我帽(图5G)。在一起,这些数据表明gp130-mediated激活PKC-δ通过Gab1/2 /π3K,连续调节热量和辣椒素激活离子电流。
下游信号通过Gab1/2 il - 6 / gp130,π3K和PKC-δ。一个,BCapsaicin-induced离子电流被HIL-6瞬变,大大促进了。C,HIL-6适配器蛋白质的磷酸化Gab1 Gab2和π3分别K。D的便利我帽剂量依赖性抑制了π吗3K抑制剂渥曼青霉素(n= 6)。E刺激的神经元,HIL-6导致易位PKC-δ向质膜的神经元gp130fl / fl但不从SNS-gp130−−/老鼠。F量化PKC-δ易位,荧光强度测量细胞的外围和中心通过执行扫描共焦线。这一比率k的两个详细计算在材料与方法:k= 1,没有易位;k> 1,易位点;k< 1,细胞质PKC-δ的本地化。G的便利我帽由PKC-δ抑制剂抑制rottlerin (n= 6)。H下降,PWL HIL-6注射后明显减弱TRPV1−−/老鼠与wt同窝出生的(n= 6)。
的表型变化SNS-gp130−−/(缺乏热量过敏症在病理性疼痛模型)和PKC促使我们的参与来解决潜在的调制gp130 TRPV1的感觉神经元的信号。HIL-6注射后,野生型老鼠反应显著下降PWL从15.21±0.91前注入到5.10±0.77年代后1 h (p< 0.001;学生的t以及,n= 6)恢复到注射前在24 h值。TRPV1−−/老鼠,PWL下降明显减毒注射前的(15.44±1.51 vs 10.43±0.62 s后1 h) (图5H)。后一小时HIL-6注入野生型相比同窝出生的显示PWL显著下降TRPV1−−/老鼠(5.10±0.77 wt vs 10.43±0.62年代TRPV1−−/;p< 0.001;Mann-Whitney秩和检验,n= 6)。这些实验表明,TRPV1 HIL-6-induced热过敏中起着重要作用在活的有机体内和显示敏感的疼痛的神经元热是由于TRPV1的监管。这并没有导致TRPV1的表达模式的差异由于mRNA分析使用定量PCR显示TRPV1 mRNA表达水平类似的突变小鼠和野生型(数据没有显示)。
讨论
在一起,我们的数据表明,gp130表达疼痛的初级传入纤维膜的所需是非常病态的疼痛和痛觉过敏炎症的发展状况以及在癌症。我们观察到,删除gp130特别是在感觉神经减轻热痛觉过敏在活的有机体内在病理性疼痛与炎症模型背景独立的抗炎作用或调制的肿瘤的生长。我们的结果表明,gp130-Gab1 / Gab2-PI3K-PKC-δ-TRPV1通路在外围感觉神经元是一种新型的分子通路炎性细胞因子与疼痛过敏。
细胞因子il - 6和IL-6-related共享一个共同的信号受体亚基gp130广泛表达在所有细胞类型的细胞膜。与il - 6细胞因子组的其他成员,如生活、OSM,据,CT-1,可以与其他膜结合受体二聚化还子单元。常见的信号分子gp130是广泛表达,而IL-6R不是(Peters等人。,1998年)。因此,大多数的细胞类型,包括神经元,需要额外的可溶性白介素受体(Rose-John海因里希,1994;Marz et al ., 1999;Opree和克雷斯,2000)。
应用HIL-6导致显著增加热响应和活化温度的降低,这取决于神经gp130。敏化过程发生在短的延迟,这意味着一个快速的参与信号级联,而不是经典的细胞因子激活的杰纳斯激酶/信号传感器和转录的激活途径,RAS /增殖蛋白激酶通路和基因表达的变化。目前的数据支持连续gp130受体介导激活的蛋白激酶和磷酸化的热量转换离子通道,即。,heat-transducing草酸受体TRPV1 (Caterina et al ., 1997)。TRPV1在其功能分子在细胞表面温度传感器(朱利叶斯Basbaum, 2001)似乎是一个可能的候选人由il - 6通过PKC-dependent磷酸化信号。炎症介质激活PKC变得敏感TRPV1 (凯撒和麦克诺顿,1996;凯撒et al ., 1999;Premkumar埃亨,2000;Sugiura et al ., 2002)和PKC inihbitors减弱heat-activated内向电流敏感的il - 6 / gp130 (Obreja et al ., 2005)。最近的证据支持的具体参与calcium-independent同种型PKC-δil - 6 / gp130信号转导(Jain et al ., 1999;Novotny-Diermayr et al ., 2002)。事实上,我们发现易位PKC-δ刺激后感觉神经元与il - 6和IL-6-induced增加我帽在rottlerin的存在显著降低,抑制PKC-δ在神经元(Zhang et al ., 2007),但这可能附加的影响(Soltoff 2007)。TRPV1的结构展示几个胞内蛋白激酶磷酸化网站包括目标像PKA, PKC或强(Vellani et al ., 2001;Bhave et al ., 2002,2003年;Rathee et al ., 2002;金et al ., 2004;荣格et al ., 2004;Zhang et al ., 2005;Mandadi et al ., 2006)和磷酸化在这些网站离开通道的增加活动(Numazaki et al ., 2002;Mohapatra nautica, 2003;Mandadi et al ., 2006)。此外,PKC可以调节胞外分泌的TRPV1通道的胞质囊泡到质膜(Morenilla-Palao et al ., 2004),可以配合磷酸化通道蛋白的致敏解释增强神经元敏感。我们的结果扩展这些发现,我们现在提供一个新颖的信号通路的il - 6 / gp130-induced监管通过激活TRPV1 Gab1 / Gab2π3K和PKC-δ。π3K已经报告给调解的早期诱导痛觉过敏,也可以使敏感TRPV1,可能通过转译后的修改(壮族et al ., 2004)。也间接地调节通道通过上调其翻译的活动或交易(斯坦et al ., 2006)。先前已经表明,π3K快速激活细胞内的蛋白激酶,PKB / Akt,和一些PKC亚型PKC-δ(Balendran et al ., 2000;巴解组织et al ., 2004;壮族et al ., 2004;朱和牛津大学,2007年)。我们在这里展示,这在感觉神经元通路被激活。表明Gp130-mediated激活PKC-δ重大易位细胞膜离子通道,从而增加接近与感官功能。正是这种迁移PKC调节TRPV1通过磷酸化和易位到质膜,都发生在快速的时间尺度(Morenilla-Palao et al ., 2004;Premkumar et al ., 2004;Zhang et al ., 2005;Mandadi et al ., 2006)。除了TRPV1的规定,IL-6-dependent PKC-δ激活能与STAT3交互,这提高了交互的STAT3 gp130 STAT3的初始步骤激活的受体il - 6 (Novotny-Diermayr et al ., 2002)。在造血干细胞,il - 6调节膜结合的表达和可溶性IL-6Rα亚基(Campard et al ., 2006)。这种影响也可能有助于IL-6-induced伤害感受器敏感,可能进一步推动gp130激活TRPV1调控下游。IL-6R可以存在可溶性蛋白质(sIL-6R),结合配体的il - 6的分泌。这种可溶性复杂可以绑定到gp130细胞缺乏膜结合IL-6R和启动信号。这个所谓的重要性反式信号通过sIL-6R普遍接受并很有可能超过膜结合的意义IL-6R(审查,请参阅琼斯和Rose-John, 2002年;Rose-John et al ., 2006)。令人惊讶的是,sIL-R6实质上根本就不需要在我们的细胞模型中,这是与以前的工作在大鼠(Obreja et al ., 2002 a,2005年)。一般假设在许多人类组织sIL-6R作为受体激动剂结合il - 6产生il - 6的增强效果,然而,sIL-6R IL-6-antagonistic效果(审查,请参阅Knupfer Preiss, 2008)。
在炎症和癌症,il - 6生物被膜结合协调和可溶性受体(Rose-John et al ., 2006)。不仅仅在周围炎症的小鼠模型,但也在老鼠癌症疼痛模型中,我们观察到的主要贡献gp130表示在痛觉过敏的感觉神经,独立在炎症和肿瘤生长的作用本身。两种模型的特点是炎性变化和激活免疫细胞分泌促炎细胞因子,如il - 6 (江诗丹顿et al ., 2008)。临床试验,治疗的病人患有类风湿性关节炎和炎症性疼痛与中和抗体anti-IL-6R据报道,改善炎症以及相关疼痛的症状(Smolen et al ., 2008)。我们的研究结果揭示gp130外围疼痛感觉神经元表达的意义主要临床疼痛障碍的病理生理学和建议的承诺作为一个新的治疗目标。
脚注
这项工作得到了奥地利喜欢苏珥Forderung der wissenschaftlichen大幅减退(P18444),泰洛Wissenschaftsfond (UNI-0404/408)和威廉Sander-Stiftung (AZ1996.058.3)表示抗议,和by the Deutsche Forschungsgemeinschaft Germany in SFB415 (project B5) and SFB654 (project C5) and within the Cluster of Excellence “Inflammation at Interfaces” to S.R.J. We thank M. Doblander and I. Lanz for expert technical assistance and G. Gstraunthaler and E. Feifel for general support.
- 信件应该向麦克拉克雷斯博士,分工生理学、生理和医学物理、因斯布鲁克医科大学,Fritz-Pregl-Strasse 3,奥地利因斯布鲁克a - 6020。michaela.kress在{}i-med.ac.at
