文摘
过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)在调节过程中发挥作用的生物过程在大脑几乎所有的细胞类型,包括神经元。我们和其他人近日报道,药物激活PPARγ是有效的减少损害大脑不同的大脑疾病模型,包括缺血。然而,细胞类型负责PPARγ-mediated保护尚未建立。缺血,强劲PPARγ基因调节神经元,这表明神经PPARγ可能PPARγ-agonist-mediated神经保护的主要目标。了解神经PPARγ缺血性损伤的贡献,我们生成条件特异性神经元PPARγ淘汰赛老鼠(N-PPARγ-KO)。这些老鼠是可行的,似乎是正常的对他们的总行为和大脑解剖学。然而,神经元PPARγ不足导致这些老鼠经验更多的脑损伤和氧化应激在大脑中动脉闭塞的反应。主要是从N-PPARγ-KO小鼠皮层神经元,但不是星形神经胶质,暴露于缺血在体外了更大的伤害和减少了许多关键基因产物的表达可以解释增加的脆弱性,包括SOD1(超氧化物歧化酶1),过氧化氢酶、谷胱甘肽年代转移酶、解偶联蛋白1或转录因子X receptor-α肝脏。同时,PPARγagonist-based神经保护作用在神经元N-PPARγ神经元丢失。因此,我们得出这样的结论:PPARγ神经元起到重要的保护作用,PPARγ受体激动剂可能在神经自卫工具,除了良好的抗炎效果。
介绍
的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs),包括α、γ、δ/β由单独的基因,编码是配体依赖性转录因子核受体超家族的成员(Kliewer et al ., 1994;1995年Mangelsdorf et al .,积累;Chinetti et al ., 2000;伯杰和穆勒,2002)。通常,PPARγ调节基因转录的绑定守恒的DNA序列称为PPRE(过氧物酶体扩散国的反应元素),与视黄形成X受体。受体激动剂PPARγ包括脂肪酸、非甾体类抗炎药物(莱曼et al ., 1995)15 d-Δ自然发生的12日,14日-PGJ2(福尔曼et al ., 1995;Kliewer et al ., 1995;里克特et al ., 1998;罗恩et al ., 2001)和一个类的合成化合物,thiazolidinediones (Stumvoll和哈林,2002年)。PPARγ最初表现为脂肪组织作为管理者的脂质和糖代谢;然而,新的证据表明PPARγ存在于大多数细胞类型,它介导多峰函数(Giannini et al ., 2004)。最近,PPARγ被发现在神经元,但其功能尚不明朗。PPARγ的活化剂,包括15 d-pgj2或thiazolidinediones管理动物缺血的发作之前或之后,减少缺血性损伤(Shimazu et al ., 2005;Sundararajan et al ., 2005;Ou et al ., 2006;维克多et al ., 2006;Tureyen et al ., 2007)。减少促炎反应,antiatherosclerotic活动,提出了抗氧化作用机制的有益作用PPARγ活化剂(江et al ., 1998;Chinetti et al ., 2000;Giannini et al ., 2004;佩雷拉et al ., 2005;Sundararajan et al ., 2005;赵et al ., 2005)。我们和其他人证明PPARγ活化剂在文化保护神经元NMDA-induced细胞毒性(Uryu et al ., 2002;赵et al ., 2006 b),这表明PPARγ通过机制,保护大脑免受缺血神经元直接目标和独立于炎症或其他外在的因素。non-neuronal组织中,PPARγ促进众多基因的表达产品的概要文件的活动可能与氧化应激的抑制,适当的线粒体功能,或脂质和葡萄糖代谢和运输(Yoo et al ., 1999;秋山et al ., 2002;Girnun et al ., 2002;Russo报称et al ., 2003;Romera et al ., 2007)。假设神经组织可以使用PPARγ以类似方式的non-neuronal细胞,神经元的功能PPARγ可能采取行动保护神经元免受损害。
这里,来评估神经的作用PPARγ对缺血性损伤的易感性,我们生成的特异性神经元PPARγnull老鼠用α-Ca Cre-loxP技术和利用2 +/ calmodulin-dependent蛋白激酶2(αCaM-KII)实现神经元特异性启动子(凯利et al ., 1987;钱et al ., 1996)。这些突变小鼠受到缺血性损伤使用单侧大脑中/颈总动脉阻塞。我们也从这些老鼠捕捉文化生成的神经元基因表达在神经元的变化由于PPARγ删除。我们的研究显示,神经元PPARγ缺乏与增强缺血性损伤,根据形态和功能分析。此外,从PPARγ突变老鼠证明受损神经元的表达很多prosurvival基因产物和遭受更多的伤害包括氧化应激时受到缺血在体外。
材料和方法
动物。
所有的实验都在3-6-month-old雄性和雌性老鼠。所有的动物都与C57BL / 6句话的压力。老鼠标准鼠标饮食和安置在标准老鼠笼子在12 h倒光/暗周期。上午10点到下午4点之间的行为分析小鼠体重的测量,食物摄入量,和脑血脉管系统、数据收集和比较在同窝出生的。血糖测定wholevenous血液通过使用自动glucometer(第一次接触基本;Lifescan)。实验过程都是通过制度动物保健委员会在休斯顿德克萨斯大学健康科学中心。
代neuronal-specific PPARγ突变小鼠。
液氧(fl) PPARγ(PPARγfl / fl)小鼠(B6.129 -Ppargtm2Rev;杰克逊实验室;股票与αCaM-KII-Cre老鼠(# 004584)交叉崔et al ., 2005)生成neuronal-specific PPARγ淘汰赛老鼠,αCaM-KII-Cre / PPAR/ f(N-PPARγ-KO)。具体来说,我们使用了tg - 62 - cre行包含一个6.2 kbαCaM-KII启动子区域(崔et al ., 2004)。αCaM-KII基因被授予与tissue-selectivity特异性神经元表达主要在成年人的前脑,包括海马、皮质和caudate-putamen (凯利et al ., 1987;奥尔森et al ., 1995;钱et al ., 1996)。因此,通过将Cre cDNAαCaM-KII启动子的控制下,neuronal-specific Cre表达式可以实现(钱et al ., 1996)。的PPARγfl / fl老鼠有两个loxP网站介绍的两侧PPARγ的外显子1和2。Cre-mediated删除外显子1和2导致亏损PPARγ(他et al ., 2003年)。具体来说,生成N-PPARγ-KO,αCaM-KII-Cre PPARγ首先在老鼠的交叉fl / fl小鼠产生αCaM-KII-Cre / PPARf / +老鼠(大约一半的后代产生这些十字架)。第二,αCaM-KII-Cre / PPARfl / +老鼠又PPARγ交配fl / fl小鼠产生N-PPARγ-KO老鼠。这第二个十字路口删除PPARγ等位基因的两个副本αCaM-KII-Cre-expressing神经元。两个PPARγfl / fl和αCaM-KII-Cre在C57BL / 6小鼠保持至少6代的遗传背景。PPARγfl / fl老鼠被用作控制。三到六个月大的动物被用于在活的有机体内实验,1-d-old产后幼崽(p1)是用于组织培养实验。
基因分型。
多用于确定αCaM-KII-Cre转基因,PPARγ-LoxP N-PPARγ-KO老鼠是由PCR方法。PCR引物序列和条件中列出表1。Cre的表达和重组PPARγN-PPARγ-KO老鼠或培养的神经元进行了测试与逆转录酶聚合酶链反应(RT)。PCR引物序列和条件中列出表2。在测试中的重组PPARγN-PPARγ-KO老鼠,底漆对上市表2放大一个完整PPARγ乐队在700个基点和两个重组PPARγ乐队在400和300个基点。300个基点乐队有精确的序列预测的删除loxP-flanked地区。300个基点的400个基点的产品是相同的产品,除了一个额外的100个基点intronic序列的基因内区三个PPARγ拼接成的成绩单(Hevener et al ., 2003)。
LacZ染色检测Cre表达模式。
老鼠携带Tg-Cre越过了β-actin发起人loxP-stoploxP-LacZ转基因老鼠在我们前面描述的(崔et al ., 2005)。The double transgenic mice (carrying Tg–Cre and Tg–LacZ) were examined at 25 d old. The staining procedure using X-gal solution was performed exactly as we described previously (崔et al ., 2005)。
在小鼠缺血模型。
在这个实验中,我们使用3-6-month-old动物。局灶性缺血诱导的左大脑中动脉(MCA)和左颈总动脉(CCA)闭塞,正如我们前面描述的(Aronowski et al ., 2000)。简单地说,所有的动物禁食过夜了随意水,然后用0.35克/公斤ip注射麻醉水合氯醛。一个注入2 h的持续提供的水合氯醛麻醉。直肠温度监控和维护在36.5±0.5°C在缺血和再灌注的第一个小时使用前馈温度控制器(YSI模型72)使用加热灯和变暖的毯子。通过了一个口子左颞肌垂直于一条线之间的外耳道和外眦的左眼。直接可视化手术显微镜下,磨孔钻在1.5毫米吻侧的融合与鳞状骨骨暴露左侧颧弓MCA吻侧鼻腔的裂缝。一个0.005英寸的直径不锈钢丝(小部件)放置在左侧大脑中动脉吻侧鼻腔的裂缝,近端MCA的主要分歧,纹状体外动脉增和远端。动脉被解除,顺时针方向旋转。海菲兹CCA使用防止损伤的闭塞动脉瘤夹。再灌注后60分钟建立了闭塞首先移除CCA的动脉瘤夹,然后逆时针旋转线从下面MCA和删除它。中断流过MCA在显微镜下检查,验证了脑灌注(CP)测量使用激光多普勒流量计(LDF BPM2模型; Vasamedics). We used LDF to monitor CP at baseline (before occlusion), during MCA/CCA occlusion (at 5 and 55 min from the onset of occlusion), as well as during reperfusion (5 min after reversal of occlusion). The CP was collected by placing LDF probe on the surface of the skull at the location (3.5 mm caudal and 1.5 mm laterally to the bregma) that representing the ischemic penumbra.
梗死体积测量。
梗死体积测量我们前面描述的(Aronowski et al ., 1997)。简而言之,腹腔内注射的老鼠深麻醉0.6克/公斤的水合氯醛;心脏内的灌注与40毫升的冰冷的PBS之前执行动物被斩首。大脑被切成2毫米日冕部分使用塑料模具。的部分沾2% 2、3、去除氯(TTC) 30分钟在室温和福尔马林固定在10%。每个部分的图像数字化,梗死体积测定morphometrically用NIH ImageJ软件。梗塞由我们的协议是局限于皮层组织。梗死体积(毫米3)计算之间的区别的体积侧皮层和TTC-stained的体积(非缺血型)部分同侧皮层的老鼠。这间接梗塞体积的测量,基于同侧和对侧的假设的体积皮质缺血前是一样的,纠正的梗塞总额水肿组件(Swanson et al ., 1990)。
神经系统功能障碍分析。
所有行为测试鼠标进行在一个安静的,昏暗的房间由一个实验者蒙蔽对治疗组。预备考试进行排除动物异常行为。结合分数从一连串的行为测试(脚步犯规,前肢,姿势反射,缸测试)来测量神经功能赤字作为我们先前报道(赵et al ., 2007 a)。
初级皮层神经元的文化。
皮层的神经元文化生成的同胞N-PPARγ-KO(出生后24小时内)和控制(LoxP)老鼠。首先,皮质被磨碎切割和分离为我们前面描述的(赵et al ., 2006 b)。聚-镀分离细胞l与B27 -lysine-coated文化板块neurobasal中细胞密度300 - 700毫米2。这些细胞被维护在一个有限公司2孵化器(5%股份有限公司2)为37.0±0.5°C。在文化24 h后,细胞治疗48 h为0.1μ米阿糖胞苷(Ara-C)抑制神经胶质的增长。后15 d文化,形成广泛的轴突和树突细胞网络和准备实验。Cre和PPARγ这些神经元的表达文化决定在5、9和15 d后文化在体外。
主要神经胶质的文化。
主神经胶质文化准备使用相同的方法,我们所描述的神经元文化除了细胞在DMEM培养没有Ara-C加上10%胎牛血清。后15 d在文化、细胞受到震动过程在220转2 h消除神经元。紧密连接的神经胶质细胞被用作测量glia-enriched细胞的细胞特异性oxygen-glucose剥夺(OGD)受伤。
乳酸脱氢酶测定的活动。
乳酸脱氢酶(LDH)的释放到培养基使用分光光度计测量和LDH测定工具包(Promega)正如我们前面描述的(赵et al ., 2006 b)。
免疫组织化学和神经元计数。
培养神经元生长在德国玻璃固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟(DAB染色)或用95%甲醇含5%醋酸−15°C 10分钟。微管相关蛋白(MAP2)组织化学染色Cre, NeuN或胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)是由孵化细胞(1)MAP2兔多克隆抗体(1:1000;Sigma-Aldrich轻拍),(2)MAP2鸡多克隆抗体(1:1000;Abcam;免疫荧光),(3)Cre兔多克隆抗体(Novagen;1:1000),(4)山羊多克隆抗体对GFAP(1:1000),和(5)小鼠单克隆NeuN(微孔生物研究试剂;一夜之间1:1000)在4°C。MAP2信号是用一个山羊anti-rabbit ABC精英工具包(向量实验室)其次是轻拍(向量实验室)。山羊anti-rabbit IgG-Alexa萤石488年兔抗体IgG-Alexa萤石546年,山羊anti-mouse IgG-Alexa萤石488或山羊anti-chicken IgG-Alexa萤石546(在1:10 0;英杰公司)被用来可视化使用协议我们前面描述的(剩下的抗原赵et al ., 2006 b)。赫斯特33258年(1μg /毫升;英杰公司)是应用于染色细胞核。染色被捕使用蔡司光学Axioscop 2显微镜配备机动阶段和CoolSnap ES(光度)相机由MetaMorph软件。
我们使用10-μm-thin cryosections大脑为NeuN污渍我们前面描述的(Felberg et al ., 2002)。免疫荧光图像的三个预选区域大脑皮层和海马齿状回(相同的解剖位置用于每个动物)被记录下来。神经元(NeuN-positive细胞)是计算使用MetaMorph程序集识别荧光像素(immunofluorescent细胞)。每个区域受到神经元计数设置为300×300μm。六个地区被数/每只动物。每组三个动物被用于分析。
OGD损伤模型。
13 - fifteen-day-old初级皮层神经元或神经胶质在文化受到OGD正如我们先前报道(金正日et al ., 2004)。短暂,文化媒体取代neurobasal介质没有葡萄糖,和文化是放置在一个气密湿润室充满5%的股份有限公司2/ 95% N21 h为神经胶质神经元和2 h。年底OGD,文化是回到原来的文化条件和维护24 h。在实验中使用罗格列酮(0.5μ米最终浓度),化合物添加到培养基诱导OGD前30分钟,然后在媒体上保持整个经济复苏时期。
氧化压力测量。
培养神经元氧化应激是衡量评估蛋白质和脂质氧化损伤,正如我们先前的报道(赵et al ., 2007 b)。简单、样品含有2μg蛋白质硝化纤维膜上的细胞溶解产物被发现使用Bio-Rad点状系统。风干后,探讨了膜与anti-nitrotyrosine (3′- nt;北部生物技术;1μg /毫升)和anti-4-hydroxynone (4-HNE;微孔生物研究试剂;AB5605)抗体测定蛋白质和脂质氧化损伤,分别。这些墨迹在山羊anti-rabbit-HRP孵化(1:5000)45分钟,和抗体是可视化增强化学发光(皮尔斯)。Semiquantification x射线胶片的信号是通过使用计算机辅助的光密度分析柯达分析(eda 290)。
神经丝退化。
细胞溶解产物(20μg)从15-d-old控制和N-PPARγ-KO-cultured神经元(来自大脑皮层)后24 h 1 h (OGD受到sds - page及免疫印迹紧随其后。兔子anti-neurofilament (NF) - m和NF-L抗体(Abcam)被用作我们前面描述的(Aronowski et al ., 1999)。Immonopositive乐队代表NF-M和NF-L semiquantified使用densitometrical分析、eda 290系统。
rt - pcr。
rt - pcr的mRNA水平semiquantified正如我们先前的报道(赵et al ., 2007 a)。我们使用鼠标glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)基因作为内部控制。PCR包括控制每组样本运行没有RNA,或RT一步是省略了确保PCR产品纯化mRNA的放大而不是引起的基因组DNA。相对应的周期数指数放大阶段是决定单独为每个基因和每个准备cycle-product曲线。引物的序列和周期数接受量化中列出表2。PCR产品运行在1 - 2%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色。图像数字化,每个波段的光密度是使用计算机辅助柯达量化分析(eda) 290系统。(光密度)是第一个规范化的数据内部控制(GAPDH),然后对汽车表示百分比变化控制。
统计分析。
所有数据都表示为±SEM。为在体外实验中,我们集中样本三个文化井和重复实验三次,除非另有说明在图中传说。我们用GraphPad和InStat项目进行统计分析。我们用单向方差分析多重比较的Newman-Keuls测试后紧随其后。Nonpairedt测试时使用两组进行比较。差异被认为是重要的如果p≤0.05。
结果
N-PPARγ-KO老鼠
研究PPARγ神经元,我们生成N-PPARγ-KO老鼠使用Cre-loxP复合系统。在PPAR实现神经元选择性删除,我们越过PPARγfl / fl老鼠老鼠表达Cre下井特征αCaM-KII启动子驱动Cre表达式(奥尔森et al ., 1995;钱et al ., 1996;崔et al ., 2005)。这里,我们专门使用tg - cre - 62线的老鼠,允许Cre-loxP-mediated重组完成产后第三周和局限于大脑皮层,纹状体和海马在前脑(图1一个展示了Cre-loxP重组模式与lacZ染色)(钱et al ., 1996;崔et al ., 2005)。正如预期的那样,我们决定一个强大存在Cre表达和丰富的Cre-mediated重组PPARγ-液氧等位基因在组织样本N-PPARγ老鼠的大脑皮层,决定在3个月大的时候(图1B)。
一个,照片LacZ染色的tg - 62 - Cre鼠标显示Cre / LoxP重组模式。矢状切面显示Cre / loxP重组(蓝色半乳糖苷信号)仅限于前脑区域和主要是大脑皮层,纹状体和海马。伊红是用于复染色。B通过rt - pcr分析,检测突变PPARγmRNA。信使rna的Cre和PPARγ孤立的从大脑皮层N-PPARγ-KO LoxP(控制)的老鼠在3个月的年龄。箭头指示的Cre产品(上)和重组300个基点和400个基点PPARγPCR产品(下)(见材料与方法更多细节)。注意表达Cre符合外观独特的rt - pcr乐队特定于重组PPARγ的碎片。C,控制(图)的底部和N-PPARγ-KO老鼠有正常的外观。D,NeuN免疫荧光(绿色)演示了神经元密度和分布在N-PPARγ-KO (D-F)和控制(胃肠道老鼠)。日冕部分通过整个大脑(D,G齿状回的)、门(E,我)和大脑皮层(F,H老鼠)的代表在3个月的年龄。J条形图,总结说明神经元(NeuN-positive细胞)计数在大脑皮层和海马的变性回Lox-P(控制;续)和N-PPARγ-KO (KO)老鼠。每个数300×300μm覆盖区域。数据表示为均值±SEM (n= 6字段数在3动物)。K,表达astroglia-specific PPARγ基因目标,EAAT2,不影响皮质N-PPARγ-KO,与控制老鼠相比,确认神经元特异性的基因敲除。
N-PPARγ-KO老鼠有正常的外观(图1C),似乎是正常的对他们的大脑结构,由视觉检查在海马体和大脑皮层神经元(图1D,G)。海马(图1E)和皮质(图1F)神经元N-PPARγ-KO老鼠看起来形态完整并展示类似的神经结构/解剖学(图1H,我)和密度(图1J)控制老鼠,这表明PPARγ缺陷本身并不足以引起神经元丢失或有缺陷的大脑发育。这个概念进一步支持类似的低丰度的TUNEL-positive Hoechst-stained细胞核的细胞或apoptosis-like形态学N-PPARγ-KO小鼠大脑皮层和海马,决定在1、3和6个月的年龄(数据不包括)。N-PPARγ突变很可能并不影响在星形神经胶质PPARγ活动,作为兴奋性氨基酸转运蛋白2的表达(EAAT2)的控制下是PPARγ和主要表达在星形胶质细胞(Romera et al ., 2007)是不受影响的前脑N-PPARγ-KO (图1K)。
神经元PPARγ缺陷不影响动物生长和体重(暗示完整的代谢),体温,日常行为活动,大脑血管解剖学和再现性,通过检查确定小鼠出生后6个月。没有差异,血糖,血压,和等离子体离子(Na+K+、钙2 +,Cl−,NaHCO−)成分neuron-PPARγ-KO和控制老鼠(数据未显示)。在5个月的年龄,体重N-PPARγ-KO和控制老鼠相似,分别为24.7±2.4 g (n= 8)和24.1±3.9克(n分别= 8)。
N-PPARγ-KO老鼠更容易受到局部脑缺血
∼3 - 6个月的年龄,随机选择的男性和女性N-PPARγ-KO老鼠和年龄,sex-matched同窝出生仔畜控制受到瞬态60分钟MCA /存储的再灌注3 d紧随其后。这种缺血的损伤产生方法仅限于皮层组织,重叠Cre分布的表达式。为了应对缺血,N-PPARγ-KO老鼠发达梗塞大40%,而控制老鼠(28.9±4.5毫米3vs 17.4±2.3毫米3梗死体积)(图2一个,C)。缺血性损害的脆弱性增加是最有可能不依赖于性别,因为男性和女性N-PPARγ-KO老鼠表现出强烈的趋势(男性)或统计差异(女性)对脆弱性增加缺血性损伤(图2B)。梗死的大量N-PPARγ-KO老鼠恰逢增加神经功能障碍(NDS) (图2D),指示密切关联的组织学损伤和神经赤字。
神经元PPARγ缺乏加剧脑缺血性损伤。N-PPARγ-KO (KO)和控制(Lox-P)小鼠受到可逆60分钟MCA / CCA闭塞。一个,梗塞卷代表综合的控制(白色填充)和KO(灰色填充)小鼠(个别老鼠表示为正方形或钻石在每个组),(B)按性别隔离(M,男;F,女;数量低于每个竖条表示样本大小),*p< 0.05,梗塞区(C六点)rostrocaudal平原地貌形态示量分析的测定TTC-stained大脑的部分在3 d后缺血。代表的照片TTC-stained大脑部分划分梗塞控制(Lox-P)和N-PPARγ-KO (KO)小鼠(包含在一个)。梗死体积在所有组成立3 d后缺血。D条形图说明NDS,缺血后以3 d使用电池的行为测试。每个栏下面数量表示样本大小。*p< 0.05。E,条形图说明脑灌注值peri-ischemic地区的控制(n= 10)和N-PPARγ-KO老鼠(n= 11)在四个时间点代表缺血前5分钟(Preischemia;基线),5分钟和诱导缺血后55分钟,10分钟后的逆转闭塞(再灌注)用激光多普勒测量flowmetry。结果提出了均值±SEM。
脆弱性增加缺血性损伤可能不是由于CP灌注值的变化在N-PPARγ-KO老鼠基线(阻塞之前),在缺血和再灌注期间N-PPARγ-KO和控制老鼠之间是没有区别的(图2E)。
最后,在手术/中风相关的死亡率之间没有区别N-PPARγ-KO和控制老鼠。死亡率29%,26日控制和淘汰赛集团。后的第一个24小时内的所有死亡发生中风。
主要N-PPARγ-KO小鼠神经元显示PPARγ和PPARγ-dependent基因的表达
为了更好地理解PPARγ删除配置文件和后果的神经元,我们使用主要neuron-glia coculture或neuron-enriched文化系统和N-PPARγ-KO老鼠的PPARγ零神经元。早些时候发表的研究表明,αCaM-KII启动子的活性几乎没有检测到第四天产后但高达十倍增加了16天(朔尔茨et al ., 1988;Burgin et al ., 1990)。同意这项研究中,神经元αCaM-KII推广活动,以Cre mRNA表达,是微不足道的长达9 d (图3一个),其次是一个健壮的增加在15天。此外,Cre蛋白表达是局限于细胞核,确定使用Cre蛋白的免疫反应性神经元/神经胶质coculture系统(图3B)。进一步研究使用双重免疫染色Cre和特异性标记表明Cre colocalizes核的神经元(NeuN-positive细胞)(图3C)但不是星形神经胶质(GFAP-positive细胞)(图3D)。Cre表达式PPARγ培养神经元恰逢重大损失的蛋白质(图3E),证明它可以导致神经元使用PPARγ基因击倒αCaM-KII promoter-driven Cre表达式。
一个,rt - pcr凝胶的照片展示的Cre重组酶产生N-PPARγ-KO皮质的神经元在文化和控制(Lox-P)老鼠,和免疫组织化学(B)Cre蛋白质neuron-glial coculture表明Cre本地化主要是核的细胞与神经元形态学(红色箭头),但不是小神经胶质细胞(蓝色箭头)。C,D免疫荧光,表明Cre immunopositive细胞培养的神经元colocalize MAP2 immunopositive (C),但不要GFAP immunopositive (D)细胞neuron-glia coculture。细胞染色Cre(绿色),MAP2(神经元;红色;C)、GFAP(星形神经胶质;红色;D)和原子核(赫斯特33258;蓝色)。箭在C确定细胞阳性Cre和MAP2和箭头D识别GFAP-positive细胞的细胞核。注意,免疫荧光的Cre不重叠GFAP-positive细胞的细胞核的位置。E柱状图(n= 3)和免疫印迹展示PPARγ代表和β-actin蛋白质水平(通过densitometrical分析确定)生成的神经元在文化从N-PPARγ-KO和控制(Lox-P)小鼠,在15 d文化。F,G、量化的mRNA表达在神经元的文化。F、照片代表琼脂糖凝胶的rt - pcr产品和条形图(G)的光密度定量rt - pcr的产品选择PPARγ-regulated基因在神经文化产生N-PPARγ-KO (KO)和控制(Lox-P)小鼠,衡量后15 d文化。Synaptophysin (SYNAPT)和GAPDH被用作参考的控制。数据表示为均值±SEM (n= 5 - 6)。在E和G,*p从控制≤0.05。
在协议的后果缺乏PPARγ表达神经元,我们观察到显著减少PPARγ-dependent基因表达(图3F,G),研究了15-d-old培养皮层神经元。其中包括基因编码的酶参与中和活性氧自由基,如铜、Zn-superoxide歧化酶(SOD1)、过氧化氢酶、谷胱甘肽年代转移酶(GST),酶参与线粒体正常运转、解偶联蛋白1 (UCP-1),酶参与脂类代谢,肝脏脂蛋白脂肪酶(LPL)和转录因子X receptor-α(LXRα)。尽管我们发现减少规范PPARγ基因产物的表达,没有变化在GAPDH或synaptophysin基因的表达。这表明,基因表达的改变是特定于PPARγ目标和赤字的PPARγ神经元不足以妥协神经元完整性包括synapse-associated蛋白质的存在,synaptophysin通常被认为是一个代理突触密度变化的标志。
PPARγ-deficient在神经元呈现神经元更容易OGD-induced损伤
建立PPARγ和神经元对缺血性损伤的易感性之间的关系,我们首先受到N-PPARγ-KO收获的培养神经元和控制老鼠OGD受伤。量化LDH水平评估的损害和氧化应激蛋白质(3 nt)和脂质(4-HNE)。同时,我们分析了基于神经丝的神经突损伤损失(使用免疫印迹)和总MAP2免疫组织化学研究的形态学特征。所有这些在24 h后OGD进行了分析。
正如预测的那样的在活的有机体内实验中,PPARγ-deficient神经元响应OGD证明比控制神经元,更严重损害与化验确定LDH释放(图4一个),形态学损伤(图4B),神经丝蛋白水解作用(图4C)和氧化应激(图4F)。同意PPARγ的防护功能,PPARγ-deficient神经元在接触OGD受伤没有受益于治疗PPARγ-activating代理,罗格列酮,而控制神经元(图4一个)。因为OGD-mediated损害是至少部分与氧化应激有关,我们测试的假设PPARγ缺乏处理氧化减少神经元的能力的侮辱。再一次,我们使用培养的神经元N-PPARγ-KO老鼠和接受他们有毒的过氧化氢氧化应激模型。与我们的假设一致,PPARγ-deficient神经元更容易受到氢peroxide-induced损伤(图4D)。
PPARγ不足使神经元更容易受到伤害。Neuron-enriched文化(模拟,F)和glia-enriched文化(E),产生的控制(LoxP)和N-PPARγ-KO小鼠暴露于OGD (KO),和水平的损伤在24 h决心使用LDH测定(一个,E),损失MAP2完整性(B)、氧化应激(F;immuno-dot污点3′- nt和4-HNE)和神经丝水解(C;父NF-L NF-M蛋白免疫印迹)。PPARγ受体激动剂的影响,罗格列酮(ROS)在控制和N-PPARγ-KO OGD-induced损伤(KO)也说明(一个;最后2条)。D文化,条形图说明LDH释放神经元产生LoxP和N-PPARγ-KO小鼠H2O2全身的伤害。在f,n在一式三份(即= 3独立实验。3文化/实验)。*p从控制≤0.05;* *p< 0.05 KO和LoxP没有ROS。
的neuron-selective PPARγ删除似乎没有影响其他脑细胞缺血的脆弱性。Glia-enriched文化从N-PPARγ-KO老鼠受到OGD证明无特征的水平控制老鼠的损伤与神经胶质图4E)。
讨论
在这项研究中,对深入理解神经元PPARγ的角色,我们生成neuronal-specific PPARγ淘汰赛鼠标使用LoxP-Cre系统。这些突变小鼠是完全可行的,有完整的大脑解剖,似乎正常发育。因为我们使用αCaM-KII实现选择性表达启动子的Cre神经元,我们很可能能够保留原状产前发育过程,自感应αCaM-KII启动子(这里使用Cre开车的表情;因此突变)不发生直到产后早期天(Burgin et al ., 1990)。在这项研究中,我们使用tg - cre - 62小鼠(崔et al ., 2004前脑)范围Cre重组酶的表达,因此重叠中脑动脉区域(大脑的ischemia-affected方面)。我们的结果表明,这些PPARγ-deficient老鼠的反应受到更广泛的损伤MCA / CCA阻塞,增加梗死体积和显示的功能赤字更为明显。这加重损害可能不是由于改变脑灌注,由于激光多普勒数据表明,控制和N-PPARγ-KO老鼠证明类似水平的血液灌注减少在MCA闭塞,以及类似水平的灌注缺血后早期阶段。缺乏PPARγ参与脑灌注在这个研究是符合我们之前和别人的报告,表明PPARγ-activating代理减少缺血性损伤不影响intraischemic和缺血后早期脑灌注(赵et al ., 2005;维克多et al ., 2006;Tureyen et al ., 2007)。尽管PPARγ血管细胞,它表达的是扮演多样化的监管角色(拜尔et al ., 2008),其功能在急性中风的上下文中,至少对血液流动的监管,似乎是有限的。这表明一些过程介导通过PPARγ内神经元保护神经元免受缺血性损伤。为了验证这个假设,我们从N-PPARγ-KO老鼠和探索培养皮层神经元服从他们的脆弱性,ischemia-like或氧化应激损伤在体外。符合这一假说,缺乏PPARγ神经元损失增加的表现回应缺血性或氧化的侮辱。此外,在协议prosurvival PPARγ的作用,神经元缺乏PPARγ(与控制神经元)没有受益于PPARγ受体激动剂的保护作用,罗格列酮。这个实验也表明罗格列酮事实上需要PPARγ提供神经保护效应。重要的是要注意,PPARγ缺陷并不影响基线神经的健康(包括突触囊泡的糖蛋白,synaptophysin),这表明PPARγ在神经元的作用是维持cytoprotective /这些细胞的防御能力。这些结果符合我们早些时候的研究表明PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907) PPARγ浓度足以逆转神经保护作用的受体激动剂并没有导致神经损伤赵et al ., 2006 b)。
基于先前的研究与代理激活PPARγ从我们和其他实验室,这是证明PPARγ减轻炎症缺血性中风和出血性中风后(Sundararajan Landreth, 2004;Sundararajan et al ., 2005;赵et al ., 2005,2006年,一个;罗et al ., 2006;Tureyen et al ., 2007)。因为炎症经常被认为是一个过程导致继发性脑损伤(加西亚et al ., 1994;德尔Zoppo et al ., 2000;Aronowski和大厅,2005),PPARγ受体激动剂的抗炎效应,提出了作为一个关键机制PPARγ的有益作用。然而,除了它的抗炎效果,PPARγ被调节的表达一些重要的过氧化氢酶等抗氧化酵素SOD1和销售税(Yoo et al ., 1999;Girnun et al ., 2002;公园et al ., 2004),可以有效地改善氧化应激,缺血性损伤(公认的因素陈,2001)。并存这一概念,动物用PPARγ受体激动剂治疗受伤的大脑中调节过氧化氢酶和SOD1 (公园et al ., 2004;Shimazu et al ., 2005;Tureyen et al ., 2007;赵et al ., 2007 a),这表明抗氧化效果PPARγ的确可能参与缺血性脑保护。具体地说,我们的研究表明,小胶质细胞在文化对待PPARγ受体激动剂增加过氧化氢酶的表达,减少代H2O2,最终变得不那么对神经元损害,作为测试neurons-microglia cocultures (赵et al ., 2007 a)。因为促炎介质和氧化应激通过活化的小胶质细胞(神经毒性的特点高et al ., 2002;秦et al ., 2005),我们最初提出的抑制这些microglia-mediated有害的过程是一个关键组成部分PPARγ的有利影响。
虽然在改善PPARγ激活的角色小胶质细胞可能的不利影响,我们目前的研究与PPARγ-deficient神经元强烈表明,除了小胶质细胞,PPARγ很重要对缺血性神经自卫和氧化损伤。分析基因表达在神经元培养N-PPARγ-KO老鼠显示中断PPARγ损害许多基因的表达,可以改善神经元抗缺血性和氧化损伤。首先,PPARγ不足导致抗氧化过氧化氢酶表达降低,SOD,销售税,从而提供一个可能的解释增加蛋白质和脂质氧化损伤,以及这些神经元易感性增加oxygen-glucose剥夺或氧化(H2O2)损伤。除了基因产物与抗氧化功能,我们还发现了其他几个PPARγ-dependent基因与潜在能力调解anti-ischemic影响神经元中表达下调由于PPARγ缺乏症。第一个基因多效性的转录因子,LXRα。虽然我们没有测试这个可能性,减少LXRα表达式可能直接影响缺血性脆弱性增加。现有的数据表明,LXRα拥有prosurvival函数(约瑟夫et al ., 2004),LXR受体激动剂可以降低损伤后局部脑缺血损伤Sironi et al ., 2008)。另一个PPARγ-regulated基因减少PPARγ缺乏LPL神经元,一种功能的酶水解脂质和脂蛋白。虽然prosurvival LPL的函数没有被研究过,LPL丰富神经元和调节响应局部缺血(- et al ., 2004)。LPL在缺血的作用进一步功能研究是必要的。最后,我们PPARγ-deficient UCP-1的差别已经确认了对这些神经元,确认PPARγ解偶联蛋白(的监管作用凯利et al ., 1998;Villarroya et al ., 2007)。解偶联蛋白内线粒体膜蛋白消散质子梯度能够影响自由基生成和细胞生存能力在缺血和再灌注,包括心脏和大脑(Hoerter et al ., 2004;陈et al ., 2006)。我们还确定神经元缺乏PPARγnNOS没有影响,以挪士,伊诺表达培养神经元(数据不包括)。
我们对脑缺血后小鼠大脑的分析表明,选择性神经元PPARγ不足导致违反量显著增加,表明组织损伤神经元不仅拥抱还有其他non-neuronal细胞。神经基因型和表现型的变化影响的原因除了神经元细胞缺血性损伤的敏感性并不清楚,在现有文献中虽然有据可查。例如,excitotoxic侮辱(如颅内注射NMDA)优先赔偿神经元,虽然产生的病变周围excitotoxin注入由混合单元的面积损失。此外,研究与其他特异性突变小鼠缺血性脆弱性检测表明,neuronal-selective抑制剂抑制κB kinase-β(赫曼et al ., 2004)整体梗塞面积减少,而neuronal-selective低氧factor-1α不足导致增加梗死体积(Baranova et al ., 2007)。等包容性细胞失去一个可能的解释是,死亡神经元周围不利影响细胞通过细胞毒性的发布/溢出内容后损伤/溶解。因此,在N-PPARγ-KO老鼠,ischemia-induced更脆弱的过渡缺血性神经元死亡地带(远端半影),由于PPARγ不足,可能伤害邻近细胞,导致梗塞体积扩大。另外,non-neuronal细胞的损失可能会建议神经元的工具性作用在维护所有的细胞包括神经血管单元的完整性。作为一个整体,重要的是要强调,我们目前的研究提供了额外的证据,选择性神经元抗缺血改变不利影响生存的脑细胞ischemia-endangered区。
由于雌激素受体与神经保护和anti-ischemic效果(麦卡洛et al ., 2001),PPARγ直接调节雌激素receptor-αtransactivation (休斯顿et al ., 2003),我们感兴趣的建立是否PPARγ不足可能会有不同的效果在雄性和雌性小鼠缺血性漏洞。我们的数据表明,PPARγ缺陷增加缺血性脑损伤在两种性别,表明雌激素受体表达的变化或其他与性别有关的细胞过程不可能导致的整体脆弱性增加N-PPARγ-KO老鼠。
总之,我们的数据公布之前不清楚神经保护作用PPARγ神经自我保护的侮辱缺血和氧化应激等。目前的数据表明PPARγ神经元是必不可少的正常神经不好,但它起着重要的作用在保护神经元缺血性和氧化损伤的影响。这个cytoprotective角色PPARγ可能归因于感应多个prosurvival基因产物和多通道的影响。最后,我们的数据表明,PPARγ的神经保护作用加强了越来越多的证据承认PPARγ逻辑目标神经系统疾病发病机制包括缺血和/或氧化应激。
脚注
这个项目是由国立神经疾病和中风研究所Health-National赠款R01NS052791和1 r21ns057284。
- 信件应该向雅罗斯瓦夫Aronowski博士神经学部门,休斯顿,德克萨斯首页大学医学院,77030年休斯顿,德克萨斯州。J.Aronowski在}{uth.tmc.edu
