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Neuro-inflammation
研究论文
一种诊断试验的多中心比较:视神经脊髓炎中的水通道蛋白-4抗体
  1. 帕特里克水域1，
  2. 马库斯Reindl2，
  3. 艾伯特Saiz3.，
  4. 凯瑟琳Schanda2，
  5. Friederike图2，
  6. Vlastimil Kral4，
  7. 佩特拉Nytrova5，
  8. Ondrej Sobek6，
  9. Helle Hvilsted Nielsen7，
  10. 托本Barington7，
  11. Søren T Lillevang7，
  12. Zsolt Illes8，9，
  13. 克里斯汀Rentzsch10，
  14. Achim Berthele11，
  15. 赈灾发言人Timea Berki12，
  16. 莱蒂齐亚Granieri13，
  17. 安东尼奥Bertolotto13，
  18. 布鲁诺Giometto14，
  19. 路易吉Zuliani14，
  20. Dorte哈曼15，
  21. E Daniëlle范佩尔16，
  22. Rogier Hintzen16，
  23. 和平Hoftberger3.，17，
  24. 卡哥18，
  25. Manuel Comabella18，
  26. 泽维尔好吃的18，
  27. 3月Tintore18，
  28. Aksel湿婆19，
  29. Ayse Altintas19，
  30. Gunnur Deniz20.，
  31. 马克Woodhall1，
  32. 杰奎琳宫1，
  33. Friedemann保罗21，
  34. 汉斯哈22，
  35. Orhan Aktas22，
  36. 斯文Jarius23，
  37. 林Wildemann23，
  38. 基督教Vedeler24，25，
  39. 安妮·鲁伊斯26，
  40. 伊莎贝尔·莱特先生1，
  41. 彼得Trillenberg27，
  42. 莫妮卡Probst28，
  43. 桑德拉Saschenbrecker10，
  44. 安吉拉·文森特1，
  45. 罗曼Marignier26
  1. 1纳菲尔德临床神经科学系，牛津大学，牛津大学、英国
  2. 2临床神经内科首页，因斯布鲁克医科大学，因斯布鲁克、奥地利
  3. 3.神经免疫学项目，医院诊所和'Investigació August Pi i Sunyer生物医学研究所(IDIBAPS)，巴塞罗那大学，巴塞罗那、西班牙
  4. 4Zdravotni ustav se sidlem v Usti和Labem, Centrum免疫学和微生物学，乌斯提和拉伯姆捷克共和国
  5. 5神经内科首页，临床神经科学中心，第一医学院，综合大学医院和第一医学院，布拉格查尔斯大学，布拉格捷克共和国
  6. 6脑脊液和神经免疫学实验室，Topelex有限公司，布拉格捷克共和国
  7. 7临床免疫学系，欧登塞大学医院，欧登塞、丹麦
  8. 8南丹麦大学临床研究所，欧登塞、丹麦
  9. 9神经内科首页，帕森斯大学，胸大肌、匈牙利
  10. 10Euroimmun AG)，吕贝克、德国
  11. 11Klinikum rechts der Isar der TU m nchen, klinikfr神经病学，慕尼黑、德国
  12. 12免疫学与生物技术学系，帕森斯大学，胸大肌、匈牙利
  13. 13临床神经生物学组，神经科学研究所Cavalieri Ottolenghi (NICO)，大学医院San Luigi Gonzaga，地区转诊多发性硬化症中心，当过、意大利
  14. 14神经内科首页，Azienda ULSS 9 Treviso，特雷维索、意大利
  15. 15阿姆斯特丹免疫病理和血液凝固科Sanquin诊断服务中心、荷兰
  16. 16神经内科首页，MS Centre ErasMS, Erasmus MC，鹿特丹、荷兰
  17. 17神经病学研究所首页，维也纳医科大学，维也纳、奥地利
  18. 18神经免疫学服务，加泰罗尼亚esclerosi中心Múltiple (Cemcat)、希布伦谷雷切尔卡研究所、希布伦谷大学医院、Autònoma巴塞罗那大学，巴塞罗那、西班牙
  19. 19首页神经内科，伊斯坦布尔大学塞拉帕萨医学院，伊斯坦布尔、土耳其
  20. 20.免疫学系，伊斯坦布尔大学实验医学研究所，伊斯坦布尔、土耳其
  21. 21神经治疗临床研究中心(NCRC)，慈善机构 Universitätsmedizin柏林，柏林、德国
  22. 22医学院神经内科首页，Heinrich-Heine-University杜塞尔多夫，杜塞尔多夫、德国
  23. 23神经内科分子神经免疫学组首页，海德堡大学、德国
  24. 24临床医学系，卑尔根大学卑尔根,、挪威
  25. 25神经内科首页，豪克兰大学医院，卑尔根、挪威
  26. 26雷纳克理工大学医学院，里昂神经科学研究中心，神经炎症和神经肿瘤小组，里昂、法国
  27. 27神经内科首页，石勒苏益格-荷尔斯泰因大学医院，校园l贝克，吕贝克、德国
  28. 28质量保证学会，吕贝克、德国
  1. 对应到帕特里克·沃特斯博士，纳菲尔德临床神经科学部，5/6楼，约翰·拉德克利夫医院，黑德利路，英国牛津ox39du;paddy.waters在{}ndcn.ox.ac.uk

摘要

客观的细胞表面中枢神经系统蛋白抗体有助于诊断通常对免疫疗法有反应的疾病。抗体检测的评估需要反映其临床效用。我们报告了一项多中心研究水通道蛋白(AQP) 4抗体(AQP4-Ab)在视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)中的检测结果。

方法来自视神经脊髓炎(NMO)或NMOSD患者(101例)和对照组(92例)的编码样本在15个欧洲诊断中心进行了21项检测，包括活体(n=3)或基于固定细胞的检测(n=10)、流式细胞术(n=4)、免疫组织化学(n=3)和ELISA (n=1)。

结果92个对照组的测试结果确定了12种检测方法具有高度特异性(0-1假阳性结果)。50例(64%)NMO血清中的32例和51例(67%)NMOSD血清中的34例在12项高度特异性检测中至少两项呈阳性，剩下35例NMO/谱系障碍(SD)血清阴性。在临床表型和高特异性检测相结合的基础上，66例AQP4-Ab血清阳性样本建立了所有21项检测的敏感性(51.5-100%)。特异性(85.8-100%)基于92个对照样本和35个血清阴性NMO/SD患者样本。

结论基于细胞的检测总体上是最敏感和特异的，但免疫组织化学或流式细胞术在专科中心也同样准确。由于AQP4-Ab阴性NMO/SD患者需要不同的管理方法，因此使用适当的对照样本和明确的血清阴性NMOSD样本对于以临床有意义的方式评估这些检测方法至关重要。这里描述的过程可以应用于评估自身免疫神经学新发展领域的其他抗体测定。首页

这是一篇根据知识共享署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可发布的开放获取文章，该许可允许其他人以非商业方式分发，重新混合，改编，构建此作品，并以不同的条款授权其衍生作品，前提是原始作品被正确引用并且非商业性使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/jnnp-2015-312601

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    介绍

    在过去十年中，由于发现了似乎由针对水通道蛋白(AQP) 4(2005年发现)等蛋白质的抗体介导的新疾病，检测致病性抗体的检测方法变得越来越重要。1，2n-甲基-d-天冬氨酸受体(2007);3.，4甘氨酸受体(2008);5a-氨基-3-羟基-5-甲基-异恶唑油酸受体(2009);6-氨基丁酸(GABA)B受体(2009),7富含亮氨酸的胶质瘤失活1 (LGI1) (2010);8，9类接触蛋白2 (CASPR2) (2010)9，10和GABA一个受体(2014)11，12其中包括(有关评论，请参阅)。13 - 15在患者血清或脑脊液(CSF)中准确和快速地检测这些抗体可导致免疫疗法，从而降低患者的发病率和死亡率。

    视神经脊髓炎(NMO)是第一个抗体介导的中枢神经系统(CNS)疾病，在不同比例的患者中发现了明确的靶点AQP4。NMO可以在临床上定义;出现视神经炎(ON)和横贯脊髓炎(TM)发作以及与多发性硬化症(MS)不同的脑部病变的患者;16但在第一次发作时就表现出全面的症状是不寻常的。过去，许多NMO患者被误诊，并使用不足以控制NMO疾病活动的药物(如干扰素-β或natalizumab)进行治疗。然而，随着aqp4抗体检测的使用越来越多，许多首发或部分ON综合征、脊髓炎或脑干病变患者被报道含有aqp4抗体。在这些患者中，aqp4抗体阳性定义为NMO/NMO谱系障碍(NMOSD)诊断，导致延长免疫治疗，最有可能降低复发率。然而，不同研究之间aqp4抗体阳性差异很大(33-90%)，提示某些检测方法敏感性差或临床明确的NMO患者出现假阳性。17，18假阳性可能导致对积极/维持性免疫治疗需求较少的患者诊断为NMO，具有潜在的管理意义。

    传统上建立和临床定义的患者群体用于计算敏感性，但当存在“血清阴性”患者或呈现部分或非典型特征的患者时，这是困难的。在这项多中心研究中，我们比较了15个常规检测AQP4抗体的欧洲中心对混合队列患者和对照血清的AQP4测定指标。我们提出了一种系统的方法来确定最有用的临床分析。这一过程和结果对其他抗体介导的神经系统疾病在这个不断扩大的临床神经病学领域具有启示意义。首页

    方法

    道德

    参考血清的研究使用得到了牛津郡研究伦理委员会(参考文献10/H0606/56)、德国海德堡大学伦理审查委员会、匈牙利区域和国家伦理委员会(匈牙利3893.316-12464/KK4/2010和42341-2/2013/EKU)、丹麦南部地区伦理委员会(参考文献S-20120066)、法国数据保护局、医学和卫生研究伦理区域委员会的批准。西挪威(REK#3.2006.1235)，经德国柏林、杜塞尔多夫和慕尼黑的机构审查委员会(IRB)批准，并符合荷兰患者材料使用法规。

    患者样本

    所有中心要求提供8 - 10例aqp4抗体阳性或阴性的NMO或NMOSDs患者的血清或血浆样本，排除诊断不明确或诊断合并相关病理的病例，以及类似数量的明确定义的神经系统对照样本(如多发性硬化症、其他炎症性神经系统疾病)。4组只提供样品，15组只进行分析，6组提供样品并进行分析。截至2013年5月，德国euroimmune AG公司共收到来自10个中心的209份编码血清/血浆样本(16份因容量不足而被排除在外;图1，表1)。对照组包括来自头痛(39例)、多发性硬化症(35例复发缓解，2例原发性进展)患者的样本19)，临床孤立综合征(4例，均表现出MS的临床和临床旁特征)，肿瘤(1例b细胞淋巴瘤，1例结肠癌伴神经系统并发症)，Susac综合征(1例)，进行性脑脊髓炎伴强直和肌阵挛(1例)，神经肌强直(1例)，结缔组织障碍(1例)，重症肌无力(MG)(5例)和急性弥散性脑脊髓炎(1例)20.)。测试样本包括来自符合2006年NMO诊断标准的患者的50个样本16排除AQP4血清状态(35例来自不同中心，根据不同的AQP4检测结果呈血清阳性)，51例样本来自具有NMO临床特征但不符合标准的患者(9例on, 31例TM, 11例on和TM;中心提交的39例血清反应呈阳性;这些在本研究中被称为NMOSD)。NMO/谱系障碍(SD)队列以女性为主(4.6:1)，中位年龄为45岁，样本采集时间为疾病发病后中位3年(范围0-30年)，主要是在缓解期(3.35:1)。

    查看该表:
    表1

    样品来源

    Study design. The coded clinical and serological data from 209 patients were sent to the University of Lübeck, Germany. The coded serum (199) or plasma samples (10) were sent to Euroimmun, Lübeck, Germany. Sixteen samples were excluded due to insufficient volume. In total, 193 samples were recoded, aliquoted (90–100 μL) and sent on dry ice to 15 European Centres to run 21 AQP4 assays with a 17-week deadline. Each centre entered its own data online to a web-based server maintained at the Institute of Quality Assurance, Lübeck, Germany. All clinical data, assay results and sample codes were sent to Oxford, UK and Lyon, France for initial analysis. A blinded overview was sent to each centre before unblinding the study in a meeting in Paris, France, where all groups were represented.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    研究设计。209名患者的编码临床和血清学数据被发送到德国的l贝克大学。编码血清(199份)或血浆样本(10份)送至德国莱尔贝克的euroimmune公司。16个样品因体积不足被排除。总共193份样品被重新编码，引用(90-100 μL)，并在干冰上送到15个欧洲中心进行21次AQP4检测，截止日期为17周。每个中心将自己的数据在线输入到德国莱尔贝克质量保证研究所维护的基于网络的服务器上。所有临床数据、检测结果和样本代码被送往英国牛津和法国里昂进行初步分析。在法国巴黎举行的一次会议上，所有小组都有代表参加，在此之前，向每个中心发送了一份盲法概述。

    研究设置和设计

    临床和临床旁患者数据被发送到德国l贝克大学(PT)。重新编码(EDEN001-EDEN193)前，将样品保存在- 20°C下，并加入90-100 μl样品中。这些样本放在干冰上分发给15个参与的中心，所有这些中心都常规检测aqp4抗体(见图1为研究设计流程图)。总共允许进行17周的分析，结果通过德国l贝克质量保证研究所(MP)建立的密码保护的网络界面在线输入。如果一个中心使用了不止一种方法，则从不同方法获得的结果将分别输入。中心只能提供半定量结果(阴性、+、++、++或++++)或定量结果。将半定量数据转换为0-4，给出个体血清的评分。

    检测完成后，将l贝克大学的临床和临床旁数据、质量保证研究所的结果表、euroimmune的原始和新分配样本代码清单以及所有检测方案提交给两个评估组(英国牛津和法国里昂;图1)。对这些数据进行了分析，得出了一个部分未盲化的“概览”数字(见网上)补充图S1)发给所有参与者。所有小组都参加了在法国巴黎举行的一次会议，该数据集完全公开。

    化验

    共进行了21项AQP4检测(表2):三种活细胞检测(CBA);10个固定商用cba (euroimmune AG, l beck，德国)，其中3个由制造商内部运行(CBA-EI)， 7个在其他诊断中心运行(CBA-EO);四项流式细胞术(FACS);三种基于组织的间接免疫荧光检测(2;TBA-IIF)或优化的免疫组织化学技术(1;TBA-IHC);一种商用ELISA (Iason, Graz, Austria)。所有化验方案(见网上)补充附件I)和每个测试的数据都提供了(见在线)补充附件(二)。

    查看该表:
    表2

    化验

    统计数据

    使用MedCalc V.15.8计算敏感性、特异性、阳性和阴性似然比及其95% ci。测定准确度计算为((真阳性(TP)+真阴性(TN))/总样品)×100)。使用Real Statistics Resource Pack软件(Release 4.3;www.real-statistics.com)，临床明确的NMO患者;16排除aqp4抗体血清阳性的次要标准和整个队列。

    结果

    使用对照确定特定测定法

    92份编码对照样本(MS 37份，头痛39份，其他炎症疾病16份)与测试样本随机穿插发送。总的来说，21项检测中有16项在对照组中呈95%阴性。图2显示阴性(白细胞)和阳性结果(分级粉红色(低阳性)到红细胞(高阳性))。12项检测具有高度特异性(0-1假阳性检测结果;的左侧分组图2)，包括所有三个在内部进行的商业cba (CBA-EI, n=3)，七个在不同中心进行的五个(CBA-EO, n=5)，三个活体cba中的两个，四个FACS分析中的一个和三个TBA中的一个。然而，在这个阴性对照队列中，另外9项检测产生了2到10个阳性结果，其中2项检测(12和17)发现了9和10个阳性结果。然而，除了一名MG患者的一份样本在六项检测中呈阳性外，两次检测之间的任何一种血清的结果几乎没有一致性，支持结果的“假阳性”。

    Assay specificity based on results from the 92 randomised control patient samples. These comprised 37 multiple sclerosis (35 relapsing remitting, 2 primary progressive), 1 connective tissue disease, 1 neuromyotonia, 1 progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus, 4 clinically isolated syndrome, 1 acute disseminated encephalomyelitis, 1 Susac syndrome, 2 tumour (1 B-cell lymphoma, 1 colon carcinoma), 5 myasthenia gravis and 39 headache. Each column represents an individual assay (see table 2 for assay details) except for the first column which shows the serostatus assigned by the participating centre. Assays are grouped on the basis of their specificity in this cohort: assays on the left-hand side have 0 or 1 false-positive results (12 assays), whereas assays on the right-hand side have more than 1 false-positive result (9 assays). The assays are numbered 1–21: 1–3 are live cell-based assays (CBAs), whereas 4–6 are fixed CBA performed in-house at Euroimmun, 7–13 are fixed CBA performed at other European centres, 14–17 are flow cytometry assays, 18–20 are immunohistochemistry assays with detection based on enzymatic colour change (18) or fluorescence (19–20), and 21 is a commercially available ELISA (Iason). Each row represents a single serum sample. Positive results are coloured pink to red with a semiquantitative score from ‘1’ to ‘4’ inserted, whereas a negative result is white.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    基于92例随机对照患者样本结果的检测特异性。其中包括37例多发性硬化症(35例复发缓解，2例原发性进展)，1例结缔组织病，1例神经肌强直，1例进行性脑脊髓炎伴强直和肌阵挛，4例临床孤立综合征，1例急性播散性脑脊髓炎，1例Susac综合征，2例肿瘤(1例b细胞淋巴瘤，1例结肠癌)，5例重症肌无力和39例头痛。每个柱代表一个单独的分析(见表2除第一列显示参与中心指定的血清状态外，其他化验细节除外。在本队列中，检测方法根据其特异性进行分组:左侧的检测结果为0或1个假阳性结果(12个检测)，而右侧的检测结果为1个以上假阳性结果(9个检测)。检测编号为1-21:1-3是基于活细胞的检测(CBA)，而4-6是在euroimmune内部进行的固定CBA, 7-13是在其他欧洲中心进行的固定CBA, 14-17是流式细胞术检测，18 - 20是基于酶促颜色变化(18)或荧光(19-20)的免疫组织化学检测，21是市售的ELISA (Iason)。每一行代表一个血清样本。阳性结果显示为粉红色到红色，并插入半定量评分从“1”到“4”，而阴性结果显示为白色。

    定义aqp4抗体阳性的NMO

    在对照数据的基础上，任何来自临床NMO、On或TM患者的样本，如果在这些高度特异性的检测中有两项或两项以上呈阳性，则被认为是NMO/SD血清阳性。50例临床特征符合非aqp4抗体阳性NMO标准的患者结果见图3。至少有六种高度特异性的化验(在左侧)图3)鉴定出32/50的NMO血清(64%)呈阳性(全部呈血清阳性)，这些血清被归类为aqp4抗体阳性的NMO，其余18例为aqp4抗体血清阴性的NMO。所有提交的血清检测呈阴性的样本均在这些特定检测中呈阴性。然而，在18个血清阴性样本中，10个在至少一项特异性较低的检测中呈阳性(右侧)图3)，其中一份血清呈阳性。使用每个中心提供的半定量数据(评分样本从0(阴性)到4(高度阳性))，所有21项检测对临床明确的NMO患者有实质性的一致性(ICC为0.753 (95% CI 0.669至0.831)，完整数据集的ICC为0.820(0.785至0.851)。

    Defining the serostatus of patients with neuromyelitis optica (NMO). Results in patients with NMO, defined by the 2006 Wingerchuk criteria excluding AQP4 serostatus. Results are presented as in figure 2, with each column representing an individual assay, apart from the first column that shows the serostatus submitted with the sample, and each row represents an individual serum. A positive result is graded in colour from pink to red with a semiquantitative score from ‘1’ to ‘4’ inserted. A negative result is displayed as a white box. Two individual results from patients with seropositive NMO were considered unevaluable by the testing centre and were scored negative. In total, 32 of 50 NMO samples are considered seropositive as they were positive on at least two of the specific assays. The remaining 18 samples were defined as seronegative NMO, including one that was submitted as seropositive. The numbers at the bottom of the figure show the assay sensitivity (%) based on these clinically defined patients.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    确定视神经脊髓炎(NMO)患者的血清状态。根据2006年Wingerchuk标准定义的NMO患者的结果，不包括AQP4血清状态。结果如所示图2，除第一列显示随样品提交的血清状态外，每一列代表一种单独的测定，每一行代表一种单独的血清。阳性结果的颜色从粉红色到红色分级，并插入半定量分数从“1”到“4”。否定结果将显示为白色框。NMO血清阳性患者的两个个体结果被检测中心认为无法评估，并被评为阴性。总共，50个NMO样本中有32个被认为是血清阳性，因为它们在至少两种特定分析中呈阳性。其余18份样本被定义为血清阴性NMO，包括一份提交的血清阳性样本。下图底部的数字显示了基于这些临床定义的患者的检测灵敏度(%)。

    定义aqp4抗体阳性的NMOSD

    在51例NMOSD患者(9例ON, 31例TM, 11例ON和TM)的样本中发现了非常相似的结果，这些样本不符合独立于抗体状态的NMO标准。31个样本(61%)在至少4/12项高度特异性检测中呈阳性(图4)。然而，还有六种血清仅在一种或两种特异性分析中被确定为阳性，在不那么特异性的分析中也有所不同。其中3例被定义为aqp4抗体阳性，因为它们在两次检测中呈阳性，并且使用一种技术(活CBA)的结果100%一致，而其余3例在一次检测中呈阳性的样本被认为是阴性。NMOSD样本中有9份来自需要aqp4抗体血清阳性以满足2006年Wingerchuk标准的NMO患者，其中7份在21项检测中的18-21项检测中呈阳性，另外2份在所有检测中均呈阴性。总体而言，NMO和NMOSD患者的平均抗体结合评分没有差异(图5一个)。

    A heatmap of the entire data set presented in a similar fashion to figures 2 and 3. Each column is an individual assay. They are in the same order as in figures 2 and 3. Each row is an individual serum sample. Results are based on the semiquantitative scores; negative results are blue and positive results range from yellow (low positive) to red (high positive). The control samples are shown in (A) and the neuromyelitis optica (NMO) and NMO spectrum disorder (NMOSD) samples in (B). In total, 34 of 51 samples in the NMOSD are considered seropositive and 17 seronegative. The final serostatus of the NMO and NMOSD samples is listed on the right-hand side in B. The heatmap was generated using GENE-E V.3.0.204 (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    以类似的方式呈现整个数据集的热图图2和3.。每个柱是一个单独的分析。它们的顺序和里面的一样图2和3.。每一行是一个单独的血清样本。结果基于半定量分数;阴性结果为蓝色，阳性结果范围从黄色(低阳性)到红色(高阳性)。对照样本如(A)所示，视神经脊髓炎(NMO)和视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)样本如(B)所示。总的来说，51个NMOSD样本中有34个血清阳性，17个血清阴性。NMO和NMOSD样品的最终血清状态列在b的右侧。热图是使用GENE-E V.3.0.204 (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/)。

    Overall metrics of the AQP4 assays. Sixty-six samples were considered seropositive: 32 NMO and 34 NMOSD. Using the semiquantitative scores of 0–4 for each assay result, there was no difference in the average assay score across 21 assays between the NMO and NMOSD groups (A). (B–D) The assays are grouped by assay type on the x-axis with the study assay number in parentheses. The sensitivity (B) of assays was based on the samples classified as AQP4-antibody positive NMO or NMOSD (66 in total). The specificity (C) is based on the 92 control samples and the 35 seronegative NMO/SD samples. The accuracy (D) calculation was based on the categories described above: (((true positive+true negative)/total tests)×100). CBA, cell-based assay; IHC, immunohistochemistry; NMO, neuromyelitis optica; NMOSD, NMO spectrum disorder; SD, spectrum disorder.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    AQP4检测的总体指标。66例血清阳性:NMO 32例，NMOSD 34例。使用每项检测结果0-4的半定量评分，NMO组和NMOSD组之间21项检测的平均检测评分没有差异(A)。(B-D)在x轴上按检测类型分组，括号内为研究检测号。检测方法的敏感性(B)以aqp4抗体阳性NMO或NMOSD(共66份)为基础。特异性(C)基于92个对照样本和35个血清阴性NMO/SD样本。准确度(D)的计算基于上述类别:(((真阳性+真阴性)/总测试)×100)。CBA，细胞法;包含IHC,免疫组织化学;NMO，视神经脊髓炎;NMOSD, NMO谱系障碍; SD, spectrum disorder.

    总体AQP4检测指标

    检测灵敏度基于66份血清阳性样本(32份NMO, 34份NMOSD)，特异性基于92份对照样本和35份血清阴性样本(n=18)和NMOSD (n=17)。表3)。不同类型测定法的特异性、灵敏度和准确性((TP+TN)/总试验)×100见图5罪犯。三项检测100%敏感:2/3的活cba和1/4的FACS;这三种方法均基于人类AQP4-M23亚型的瞬时表达。另外10项检测灵敏度超过92%:第三种活CBA(98.5%)，一种FACS检测(97.0%)，一种使用优化的免疫组织化学而不是免疫荧光的TBA (TBA- ihc;98.5%)和7个固定cba(92.4-93.9%)，显示出良好的一致性。其余检测方法的敏感性在51.5% ~ 86.4%之间，包括3项固定CBAs(80.3 ~ 86.4%)、2项FACS(69.7%、83.3%)、2项TBA-IIF(51.5%、84.8%)和ELISA (83.3%);这些使用重组抗原的试验中有4/6使用了AQP4-M1亚型。

    查看该表:
    表3

    检测指标基于66份AQP4阳性样本和127份对照

    精度

    如果测定法的敏感性仅基于NMOSD总队列的结果，而不考虑对照样本的结果，则测定法12、14和15的敏感性(68-72%)将被认为比测定法1、2和4(62-64%)平均高6% (图2)。如果我们纳入对照队列的特异性数据，这两组检测的准确性相似(77.8%对76.2%)。然而，本研究设计并未考虑通过试验12,14和15发现的正确临床背景下的“假阳性”结果图2)。将血清阴性NMO/SD样品的结果与对照血清结果相结合，测定测定特异性，测定准确度定义为((TP+TN)/总试验数)×100)。在这种情况下，TP结果包括66例被定义为血清阳性的NMO/SD患者中的任何阳性结果，TN结果是对照组或血清阴性的NMO/SD患者样本中的任何阴性结果(图5这两组之间的准确率差异现在更清楚了(99.3% vs 93.4%)。总的来说，最准确的测定方法是活细胞的CBA或公司内部评分的固定CBA。

    MG是AQP4检测研究的混杂因素

    本研究选取5例MG无NMO/SD患者的血清作为阴性对照样本。然而，一部分MG患者继续发展为NMO。他们可能在出现NMO临床症状之前多年就出现AQP4抗体血清阳性。21在评价AQP4检测性能时，这些患者的结果难以分类，应省略。为了进一步说明这种关联，来自四个不同中心的AQP4血清阳性患者中有6例同时存在MG。

    讨论

    在过去的10年里，许多新的抗体介导的中枢神经系统疾病被发现。这些疾病属于亚急性，需要及时诊断，以便确定最佳治疗方法，但并非所有患者都具备临床综合征的全部标准，可能需要抗体呈阳性才能诊断;相反，有些患者符合临床标准，但持续“血清阴性”。许多实验室已经开发了血清或csf中的抗体测定，但目前还没有可用的质量评估系统，假阴性和假阳性结果都可能误导临床医生。在这里，15个欧洲中心对来自101名NMO或NMOSD患者和92名对照组的相同随机编码血清进行了分析。aqp4抗体阳性队列的分类基于具有正确临床表型(NMO、on、TM或on +TM)的患者，以及在研究中具有高度特异性的检测。选择过程对NMO或NMOSD患者同样有效。结果支持cba、流式细胞术和免疫组织化学在单个中心的高特异性和敏感性，并证明了多中心研究在临床定义队列中识别假阳性结果的重要性。

    我们使用NMO作为模型疾病，因为NMO患者的临床表型可以独立于抗体状态来定义，并且许多实验室正在进行AQP4抗体检测。然而，这些检测的一个重要特征是准确识别aqp4抗体阴性的NMO患者，因为他们复发较少，可能不需要这种积极的免疫治疗。22 - 24使用临床定义的队列来确定检测灵敏度的研究设计没有识别出aqp4抗体阴性的NMO患者，并且该队列中的假阳性结果将导致检测灵敏度和特异性的不正确增加。这个问题不能在单次分析研究中发现，但是当对同一样品使用多次分析以及基于结果之间的一致性得出结论时，这个问题就突出了。

    因此，随机纳入与nmosd具有共同自身免疫或神经特征的神经系统患者的样本是确定最具体检测的重要第一步。在用疾病控制数据确定特异性后，我们可以在正确的临床环境中识别至少两种最特异性检测呈阳性的患者，并将其定义为血清阳性。然后，我们能够定义血清阴性NMO患者，并使用相同的方法来定义血清阳性NMOSD患者，其中有最大的临床不确定性。将明确的血清阴性NMO和NMOSD患者加入对照队列，改善了这些检测的临床应用结果。

    这项研究后分析还表明，基于人类AQP4-M23亚型的瞬时表达，使用AQP4的M23亚型具有最佳灵敏度，排名前三的检测方法具有优势。活cba使用转染了AQP4-M23的细胞，并始终表现良好25，26但它们在技术上要求高且耗时长，限制了它们的使用，除非在专业中心。此外，我们没有研究中AQP4-M1活体CBA的数据进行直接比较。商用CBA很可能成为世界各地中心的标准;总的来说，它在内部和大多数其他中心表现良好，但有一两个中心的问题需要解决。也许令人惊讶的是，流式细胞术检测在敏感性(69.7-100%)和特异性(90.6-100%)上产生了最大的差异;然而，这些可以通过分析方法、样品处理和截止测定的差异来解释。使用类似技术的中心所提供数据的差异表明，使用个别技术的经验对所产生的数据有影响。流动法具有潜在的优势，可以一起处理许多样品，建立基于多个对照血清的切断，并以定量的方式独立建立样品的任何非特异性(例如，与未转染的细胞的非特异性结合);因此，应该进一步进行研究。固定组织切片上的免疫组织化学，最初用于确定AQP4-IgG，但被认为灵敏度较低，26在一个中心高度敏感27在那些执行昂贵的商业测试的所有分析要求的费用过高的中心，可使用抗原特异性CBA作为确认阳性的初步筛选试验。

    本研究设计改进了AQP4检测方法的评估，并提供了一种基于其他靶点比较类似检测方法的方法。然而，进一步的研究设计可以改进。应纳入更多的对照样本，特别是自身免疫样本，但应单独考虑模棱两可的患者队列，如研究AQP4抗体时MG患者的情况。在一个或两个中心，个体检测(免疫组织化学和流式细胞术)非常好。在未来的研究中，所有要测试的分析都应该在多个地点实施，以评估分析的可靠性和可重复性。此外，在单个中心进行多次检测可能有助于增加常规临床环境中检测结果的可信度，但可能影响对单个检测主观结果的解释。此外，由于所有样品都是在一次装运中发送的，因此化验不一定是在适用于可能例行提交的样品检测的条件下进行的。如在外部质量保证服务(EQAS)中一样，通过常规渠道断断续续地送到这些实验室的少量样品的持续评估对于今后监测所有中心的检测至关重要。

    抗体诊断的重要性是毋庸置疑的，现在在涉及不同形式的脑炎或脱髓鞘/白质疾病的广泛神经系统疾病中发现了大量不同的抗体。例如，aqp4抗体的鉴定对于确认NMO的临床诊断和确保最佳治疗，以及准确定义以类似方式治疗的部分表型(NMOSDs)患者非常重要。此外，根据新的NMOSD诊断标准，现在更加重视患者诊断中的检测结果。28假阳性结果，在这项研究中强调，需要避免，因为过度积极的免疫治疗的风险，在患者的替代诊断。在没有既定临床标准的疾病中，这些方面将更加重要，例如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体患者，他们可以表现出与NMO相似的表型，但不太可能遭受长期残疾。29或抗nmda受体脑炎，其诊断部分取决于抗体的检测。30.本研究证明了进行多中心特异性和敏感性比较以及识别和解决测试中的特定困难的可行性和优势。研究结果将提高aqp4抗体检测的准确性和可信度，并为在临床相关性不太确定的疾病中开展这些研究提供一种方法。

    致谢

    这项研究是在尤金·德维奇欧洲网络(EDEN)项目(ERA-Net ERARE 2)的主持下进行的。http://www.erare.eu/financed-projects/eden)。除欧洲参与AQP4抗体检测的其他13个受邀中心外，所有合作伙伴都参加了这项工作。

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    视图抽象

    脚注

    • PW和MR是共同第一作者

    • AV是资深作家

    • 贡献者PW, MR, SS, AV和RM对手稿的概念或设计做出了贡献。所有作者都负责数据的获取、分析或解释。所有作者都为重要知识内容的手稿修订做出了贡献，并批准了其最终版本。

    • 资金本研究由尤金·德维奇欧洲网络(EDEN)项目(ERA-Net ERARE 2)资助。http://www.erare.eu/financed-projects/eden)。euroimmune AG公司以50%的折扣为来自丹麦和匈牙利的群体提供检测试剂盒，并免费为两个意大利群体提供检测试剂盒。牛津大学的这项工作得到了国家卫生服务国家视神经脊髓炎专门委托小组和国家卫生研究所牛津生物医学研究中心的支持。

    • 相互竞争的利益AS由Fundació la Marató de TV3(101610)资助。FT参加了由奥地利科学基金(FWF)资助的SPIN博士项目;项目W1206)。ZI由丹麦Lundbeckfonden和Scleroseforeningen资助。AB已获得拜耳医疗保健公司关于NMO的资助。LZ要感谢RH在分析中提供的出色技术协助。RH得到了奥地利科学基金(FWF;项目J3230)。CC感谢Fundació la Marató de TV3 (493/C/2012)的资助。FP得到了德国联邦政府能力网络多发性硬化症基金会(Competence Network Multiple Sclerosis KKNMS)的资助。 BW acknowledges funding from the Dietmar-Hopp-Stiftung and from Merck Serono. RM and AR acknowledge Nathalie Dufay from NeuroBioTec-Banques (Hospices Civils de Lyon, France) and funding from Association pour la Recherche sur la Sclerose en Plaques (ARSEP). PW has received speaker honoraria from Biogen Idec and Euroimmun AG; holds a patent with Oxford University for LGI1/CASPR2 antibodies, licensed to Euroimmun AG; and for GABA一个R抗体。在研究进行期间，来自因斯布鲁克大学医院(TILAK)的其他MR报告;除提交的作品外，由euroimmune支付的个人费用。AS获得了拜耳先灵、默克雪兰诺、Biogen-Idec、赛诺菲安万特、梯瓦制药工业有限公司和诺华的咨询服务和演讲报酬。HHN获得了诺华医疗、Biogen Idec、Genzyme Denmark和Teva Denmark的旅行资助和演讲荣誉。ZI报道来自丹麦Lundbeckfonden的资助;在进行研究期间，丹麦的Scleroseforeningen;在提交的工作之外，拜耳先灵、Biogen-Idec、默克雪兰诺、诺华、赛诺菲-安万特和梯瓦制药工业有限公司的咨询服务和演讲报酬的个人费用。结核病报告说，在研究进行期间，euroimmune AG提供了非财政支持。KR是euroimmune AG的股东和雇员。 AB reports grants from Bayer Heathcare, personal fees from Biogen Idec, personal fees from Merck Serono, personal fees from Teva, personal fees from Novartis, personal fees from Genzyme, other from Biogen Idec, other from Novartis, other from Genzyme, other from Roche, other from Alexion Pharmaceuticals, outside the submitted work. LG received congress and travel compensations from Euroimmun. AB received honoraria for serving in the scientific advisory boards of Almirall, Bayer, Biogen Idec, Genzyme, and received speaker honoraria from Biogen Idec, Genzyme, Novartis, TEVA with approval by the Director of AOU San Luigi University Hospital; his institution has received grant support from Bayer, BiogenIdec, Merck, Novartis, TEVA from the Italian Multiple Sclerosis Society, Associazione Ricerca Biomedica ONLUS and San Luigi ONLUS. LZ reports personal fees from Teva Pharmaceutical, personal fees from Novartis, outside the submitted work. MC has received compensation for consulting services and speaking honoraria from Bayer Schering Pharma, Merk Serono, Biogen-Idec, Teva Pharmaceuticals, Sanofi-Aventis, Genzyme, and Novartis. XM has received speaking honoraria and travel expenses for scientific meetings, has been a steering committee member of clinical trials or participated in advisory boards of clinical trials in the past years with Bayer Schering Pharma, Biogen Idec, EMD Merck Serono, Genentech, Genzyme, Novartis, Sanofi-Aventis, Teva Phramaceuticals, Almirall and Roche. MT has received compensation for consulting services and speaking from Bayer-Schering, Merk-Serono, Biogen-Idec, Teva, Sanofi-Aventis, and Novartis. AS reports receiving grants from the Scientific and Technological Research Council of Turkey—Health Sciences Research (grants numbers 109S070 and 112S052); and also unrestricted grants from Bayer-Schering AG and Merck-Serono to their Neurology Department Clinical Neuroimmunology Unit. AS also reports receiving honoraria or consultation fees Biogen Idec, Novartis and Teva. He had received travel and registration coverage for attending several national or international congresses or symposia, from Merck Serono, Biogen Idec, Novartis, Teva, Bayer-Schering and Allergan. AA received grants to her department from The Scientific and Technological Research Institute of Turkey-Health Sciences (grants numbers 109S070 and 112S052), and she also received honoraria, research and travel grants from Teva, Merck-Serono, Gen Ilac, Bayer-Schering, Novartis. FP has received travel funding, speaker honoraria and personal compensation for activities on advisory boards and steering committees from Bayer, Biogen Idec, Alexion, Chugai, MedImmune, MerckSerono, Novartis, Teva, and Sanofi Genzyme. He has received grants from the Guthy Jackson Charitable Foundation and the National Multiple Sclerosis Society of the USA. OA reports grants from German Ministry for Education and Research (BMBF), during the conduct of the study; German Research Foundation (DFG); Hertie Foundation; Biogen; Novartis; Bayer; outside the submitted work; and Honoraria for consultancy and speaking by Biogen, Novartis, Bayer Schering, Teva, Chugai, Genzyme, MedImmune, and Merck Serono. BW reports personal fees from Bayer Healthcare, grants and personal fees from Biogen, Merck Serono; Genzyme, a Sanofi Company; Novartis Pharmaceuticals; TEVA Pharma; grants from Biotest, German Ministry of Education and Research; Dietmar Hopp Foundation; outside the submitted work. H-PH reports personal fees from MedImmune, outside the submitted work. MP is an employee of and holds stock in Euroimmun AG. PT reports non-financial support from Roche Pharmaceuticals, outside the submitted work. SS is an employee of Euroimmun AG. AV is on the Advisory Board for首页;副主编是谁大脑;与牛津大学共同拥有马斯克、LGI1/CASPR2和GABA的专利一个R抗体，并获得一定比例的版税。RM报告了MedImmune的个人费用，百健的个人费用和非财务支持，默克雪兰诺的非财务支持，梯瓦的非财务支持，诺华的非财务支持，赛诺菲的非财务支持，在提交的工作之外。

    • 伦理批准参考血清的研究使用得到了牛津郡研究伦理委员会(参考号10/H0606/56)、德国海德堡大学伦理审查委员会、匈牙利区域和国家伦理委员会(匈牙利3893.316-12464 /KK4/2010和42341-2/2013 /EKU)、丹麦南部地区伦理委员会(参考号S-20120066)、法国数据保护局、医学和卫生研究伦理区域委员会的批准。西挪威(REK#3.2006.1235)，经德国柏林、杜塞尔多夫和慕尼黑的IRB批准，并符合荷兰患者材料使用法规。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。